雄激素受体基因各功能域片段的原核表达与功能鉴定

目的系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行诱导表达,确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Western blot鉴定,分析诱导前、诱导后细菌裂解液中的目的蛋白,并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。将纯化后蛋白与病毒荧光探针进行孵育,复合物于非变性凝胶中电泳检测纯化蛋白功能。结果成功构建了AR全长和3个功能域截短体的原核表达质粒。PCR和双酶切鉴定均显示在各插入片段大小相符处出现阳性条带,且测序结果与NCBI GenBank标准株比对一致。其中,96 ku GST-AR-NTD+DBD与86 ku GST-AR-NTD两个融合蛋白得以成功表达及后续纯化。纯化蛋白可与病毒基因组DNA直接结合。结论来源同一基因序列的AR截短体重组质粒原核表达条件不同,纯化后的AR蛋白可用于深入了解AR各功能域与其他分子间的直接相互作用机制。

人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建

利用ＲＴ－ＰＣＲ从人肥大前列腺组织钓取９４个氨基酸的人前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）全长ｃＤＮＡ，序列分析结果与文献报道的完全一致．将ＰＳＰ９４成熟肽与人ＴＮＦα衍生物（ＴＮＦΔ）通过Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＡＰＧＴＰ在基因水平上融合成５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ，融合基因ＤＮＡ序列分析结果与设计的相符合．５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为３１ｋＤ，表达量约占菌体总蛋白量的３５％．以Ｌ９２９细胞和人前列腺癌细胞株ＰＣ－３为靶细胞进行细胞毒分析结果表明，５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ融合蛋白既具有ＴＮＦ的细胞毒活性。

一种新型天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体融合蛋白S的构建及表达

目的 :构建和表达一种带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和人酸性成纤维细胞生长因子 (acidicfibroblastgrowthfactor ,aFGF)突变体的融合蛋白S ,在创伤皮肤表面应用时能自动裂解成有抗感染功能的天蚕素杂合肽AD和皮肤修复功能的aFGF突变体。方法 :利用PCR技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD基因和aFGF突变体基因。再利用两者作为模板 ,用PCR方法扩增出编码融合蛋白S的DNA。将该DNA片段插入到载体pPICZαA中 ,并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd116 8中 ,Zeocin抗性筛选重组转化子。甲醇诱导 72h ,SDS -PAGE电泳检测融合蛋白S的表达 ,并用Western -blot杂交检测融合蛋白S的免疫原性。结果 :筛选出的重组转化株在甲醇诱导后能表达相对分子质量约为 190 0 0的融合蛋白S ,而该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。结论 :用PCR方法获得编码含凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体的融合蛋白SDNA 。

Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中克隆表达thanatin突变体(Th-T)蛋白并纯化。方法:PCR合成Th-T基因并克隆到pET32a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,构建Th-T原核表达载体(pET32a-Th-T)并转化到大肠杆菌BL21融合表达,通过正交实验优化表达条件,His-Bind介质纯化。考察经酶切纯化后的重组Th-T对4种供试菌的最低抑制浓度。结果:菌体在LB培养基(pH6.5)培养4.5 h,IPTG 0.4 mmol.L-1诱导7 h,Th-T融合蛋白大量可溶性表达,经药敏试验证明纯化的重组Th-T具有预期的抗菌活性。结论:本研究为通过大肠杆菌体系表达重组Th-T抗菌药物奠定了基础。

重组人白细胞介素－6与肿瘤坏死因子突变体融合蛋白的构建及表达

针对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上白细胞介素－６（ＩＬ－６）受体明显增高的事实，根据ＴＮＦ结构与功能研究的最新信息，利用ＰＣＲ技术，对人ＴＮＦα基因进行了改造，并将其与人ＩＬ－６成熟肽编码区ｃＤＮＡ通过人工接头进行融合。融合蛋白在大肠杆菌中表达后，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，分子量约为３７ｋＤ；活性检测结果证实，该融合蛋白兼具有ＴＮＦ抗肿瘤活性和结合ＩＬ－６受体的能力，在高表达ＩＬ－６受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性较同样位点突变的ＴＮＦ高约３倍。

PreIQ及其突变体载体构建表达纯化和活性鉴定

目的构建心肌L型钙通道片段PreIQ及其突变体与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化和活性鉴定。方法将PreIQ及其突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导PreIQ及其突变体的GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE鉴定目的蛋白分子质量和相对纯度。采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度。采用pull-down法检测纯化后蛋白的活性。结果 PreIQ及其突变体融合蛋白得到了大量表达;纯化的PreIQ及其突变体具有较高的纯度;纯化后蛋白能与钙调蛋白(CaM)结合,具有生物活性。结论本研究成功构建了PreIQ及其突变体融合蛋白原核表达载体,获得具有生物活性的PreIQ及其突变体融合蛋白,为深入研究PreIQ的生能学功能奠定基础。

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL—c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TPOM。方法：采用基因重组和表达、SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白纯化技术。结果：SDS-PAGE分析表明，IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36．6％。除了大肠杆菌RR1不表达以外，大肠杆菌DH5a、H101均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋白经SephacyIS-200和DEAE-SepharoseFF层析纯化后，蛋白纯度约为87．6％。结论：人血小板生成素突变体融合蛋白在大肠杆菌JM109、DH5a和H101中均获得高效表达。

SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白

通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况，从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后，生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上，前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍；在 Ｕ９３７ 细胞上，前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明， Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白．

人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

本文利用PCR技术,对人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因进行了改造,并将其与人白细胞介素-6(hIL-6)成熟肽编码区cDNA进行融合,构建了5′IL-6-TNF△融合蛋白的表达质粒pBVIL6-TNFA△。DNA序列分析证明,PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计序列及相应的cDNA序列完全一致;重组子用限制性内切酶酶切鉴定,含有正确的IL6-TNF△融合cDNA片段;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量约为37kD,与预计的相符合;生物学活性分析初步表明,该融合蛋白具有抗肿瘤活性。

钙调蛋白镁结合位点突变体载体的构建、表达纯化及鉴定

目的构建钙调蛋白3种镁离子结合位点突变体的质粒载体,并进行表达纯化及鉴定,为深入研究钙调蛋白的生物学功能奠定基础。方法利用钙调蛋白cDNA进行点突变,制备3种镁离子结合位点突变的cDNA。将突变后的cDNA分别插入pGEX-6P-3载体,制备钙调蛋白突变体载体质粒。质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,培养大肠杆菌,并诱导GST融合蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B珠子和PreScission蛋白酶分离纯化蛋白。结果酶切鉴定和DNA测序证实成功构建钙调蛋白突变体质粒;表达纯化得到的钙调蛋白突变体经电泳图鉴定纯度较高,浓度约1.0mg/mL。结论本研究成功构建了钙调蛋白镁结合位点突变体融合蛋白原核表达质粒,分离纯化可获得较高浓度较高纯度的钙调蛋白突变体。

重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达

构建编码人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重组表达质粒,在Pichia pastorisGS115中表达,获得具有较高IL-2活性的融合蛋白。设计并合成符合P.pastoris密码子偏好,且含有C125A突变的IL-2编码基因IL-2m,通过酶切连接方法将其与人血清白蛋白(HSA)的编码基因连接为融合蛋白HSA-IL2m的编码基因。克隆到表达质粒pPIC9K中,电击转化P.pastorisGS115感受态细胞,获得重组P.pastorisGS115/pPHIm基因工程菌。摇瓶发酵获得分泌表达产物。结果:Western blot鉴定结果显示该融合蛋白与IL-2、HSA的抗体都能发生免疫反应。经脱盐、冻干制备的粗蛋白的IL-2生物学活性为1.51×106IU/mg。结论:在P.pastorisGS115中成功表达了具有人白介素-2生物学活性的HSA-IL2m融合蛋白。

人γ干扰素突变体(hIFNγ135-X14)在大肠杆菌中高效表达

利用体外重组技术，将人γ干扰素／β肿瘤坏死因子融合蛋白（ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１３－ｈＴＮＦβ１４８，ｈγＴＮＦβ）的基因５′端ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１３编码序列取出，添上终止密码子，克隆到ｐＢＶ２２０表达载体ＰＲＰＬ串联起动子的下游，构建成人γ干扰素突变体（ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１４）表达质粒．在质粒构建过程中，原载体上紧接ＳＤ序列后的ＥｃｏＲ１位点被新引入的Ｘｂａ１位点所取代，重组后的质粒，ＳＤ序列与ＡＴＧ起始密码子之间的核苷酸数达到１０个．经转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α，温敏诱导表达，细菌稳定高效地表达了人γ干扰素突变体（１８ｋＤ），表达量约占菌体总蛋白的４２％，表达产物主要以包涵体形式存在．经初步纯化复性后，表达产物的干扰素（ＩＦＮ）抗病毒比活性达到１．１８×１０６Ｕ／ｍｇ蛋白．

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的克隆及表达

目的 :克隆人胰高血糖素样肽 - 1突变体 (2 Gly -hGLP - 1)基因 ,高效表达GST - 2 Gly -hGLP - 1融合蛋白。方法 :在获得重组hGLP - 1基因工程菌基础上 ,利用定点突变技术改造其第 2位丙氨酸为甘氨酸 ,经酶切克隆于pGEM - 7z(+)载体中 ,构建pGEM - 7z(+) / 2 Gly -hGLP - 1克隆载体 ,双酶切鉴定后把2 Gly-hGLP - 1基因定向插入pGEX - 4T - 3多克隆位点 ,构建pGEX- 4T - 3/ 2 Gly-hGLP - 1融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)并进行诱导表达。结果 :经双酶切鉴定和测序分析 ,证明2 Gly-hGLP - 1基因已克隆到pGEX - 4T - 3载体中。SDS -PAGE和凝胶扫描分析 ,融合蛋白以可溶形式存在 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 9.7%。表达产物经亲和层析纯化后纯度在 95 %以上 ,免疫印迹证实 ,该融合蛋白可被特异性hGLP - 1(7- 37)抗体所识别。结论 :为产业化规模制备hGLP -

新型重组毒素hIL15M/TNFαM的构建、表达与活性测定

目的 构建、表达hIL15M TNFαM融合毒素 ,为研制可消除hIL15受体高表达细胞的特异性导向药物奠定基础。方法 人白介素 15突变体 (hIL15M)对靶细胞不具有激动作用 ,将该突变体与TNFα突变体 (TNFαM)编码基因直接融合克隆至pET表达载体 ,并纯化出融合蛋白hIL15M TNFαM ,MTT法测定该蛋白的细胞毒活性。结果 SDS PAGE分析表明 ,重组菌株诱导后可以表达出 3 0× 10 3与预期大小一致的特异蛋白带。纯化的hIL15M TNFαM对PHA激活的T细胞的杀伤作用是静止性T细胞的 13倍。结论 hIL15M TNFαM融合蛋白对高表达hIL15受体的细胞具有较强的杀伤性作用 ,提示其对由活化的异常T细胞增多所致的疾病具有潜在的治疗作用。

人γ-干扰素研究进展

本文不仅综述了人γ-干扰素(hIFN-γ)分子结构的多态性,而且简介了表达载体的构建、表达和表达产物的纯化等技术方法,并对现存的问题和前景作了简要分析。

Limk1不同突变体HA融合表达载体构建及在细胞内定位

目的:构建LIM激酶(Limk)1不同突变体的HA融合表达载体,并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内定位。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增Limk1全长序列,构建HA-Limk1真核表达质粒;利用定点突变策略对HA-Limk1进行核定位信号(NLS)缺失突变,命名为Limk1-NLS(del);用合成两条互补序列退火获得目标片段插入载体的策略构建Limk1-NLS;将2表达质粒转染HepG2细胞,细胞免疫荧光方法以及核质分离后用western-blot检测其在细胞中定位。结果:经测序鉴定Limk1及其不同突变体序列正确,在HepG2细胞中高表达;其中HA-Limk1在细胞质、细胞核均有表达,Limk1-NLS(del)主要定位于细胞质,Limk1-NLS主要定位于细胞核。结论:成功构建了Limk1全长及不同突变体的HA融合表达载体,初步明确突变体在细胞内的定位。

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)无毒突变体mLT63在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达并纯化大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63融合蛋白,并探索其免疫反应性。方法采用不同的诱导温度,IPTG浓度,葡萄糖含量,pH值以及不同的培养基优化重组菌TB1(pMAL-c2X-mlt)的表达条件,表达产物经超声粉碎,超声上清经初步盐析、应用直链淀粉亲和层析柱纯化,Western blot鉴定纯化产物的免疫学反应性。结果融合蛋白在诱导表达产物中的含量达到16.11%,纯化产物的纯度达到72.58%。纯化产物能够被抗CT血清所识别。结论成功表达并纯化出了大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63,获得了纯度较高并具有良好免疫反应性的融合蛋白。

鼠疫耶尔森菌F1-V融合蛋白改构体的构建、原核表达及纯化

目的：通过基于结构的基因突变获得鼠疫耶尔森菌F1抗原突变体（F1mut）,克隆、表达并纯化F1mut-V融合蛋白。方法：通过3轮PCR,将编码F1抗原分子N端1~14位氨基酸的基因序列移到3＇端,测序无误后将F1mut基因与V基因的5＇端连接,构建改构的融合基因F1mut-V,将其克隆到原核表达载体p ET-32a后转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后,目的蛋白为可溶性表达,通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤层析纯化,用SDS-PAGE和Western印迹分析纯化产物。结果：重组F1mut-V在大肠杆菌中为可溶性表达,表达量占全菌蛋白的25%以上,纯化后目的蛋白的纯度达95%,经Western印迹检测,与抗V、F1抗体均有特异性结合。结论：重组F1mut-V有望成为新一代亚单位疫苗的有效成分。

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。

Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达

目的构建心肌Cav1.2通道CT1片段及其突变体与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体,并进行蛋白表达和纯化。方法以豚鼠Cav1.2通道CT1质粒(p GEX-6p-3/CT1)为模板,采用定点突变技术构建CT1 T1603A和CT1 T1603D两种突变体质粒。转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后用IPTG诱导GST融合蛋白表达,分离纯化后采用SDS-PAGE检测CT1及其突变体蛋白的相对分子量和纯度。结果 CT1片段及其突变体融合蛋白得到了正确、大量表达,提取纯化后的CT1片段及其突变体融合蛋白具有较高的纯度。结论成功构建了Cav1.2通道CT1片断及其突变体融合蛋白原核表达载体,获得了CT1突变体融合蛋白,为深入研究CT1片断在Cav1.2通道调节中的作用和机制奠定基础。