陆川猪MyoD1基因克隆及组织表达分析

为探究陆川猪骨骼肌生长发育过程中MyoD1基因所起作用,对陆川猪成肌细胞决定基因1(MyoD1)进行克隆,展开生物信息学分析,对其在陆川猪不同组织中的表达进行分析,以NCBI上已公布的野猪MyoD1基因序列为模板,进行特异性引物设计,克隆陆川猪MyoD1基因CDS区,并与NCBI已公布的野猪、牛、绵羊、人、小鼠、大鼠基因序列进行相似性比对,由此构建系统进化树,通过在线软件开展生物信息学分析,而后使用实时荧光定量PCR检测在陆川猪不同组织中MyoD1基因的相对表达量。陆川猪MyoD1基因CDS区全长960 bp,共编码319个氨基酸,碱基突变共存在5处,与野猪、牛、绵羊、人类、小鼠、大鼠的MyoD1基因CDS序列相似性分别为99.2%,93.0%,92.3%,90.0%,84.3%,84.0%,其中与野猪相似性最高,表明二者亲缘关系最为接近;陆川猪MyoD1基因原子总数为4680,蛋白的分子质量为33.99 ku,分子式为C_(1457)H_(2296)N_(442)O_(471)S_(14);不稳定系数为63.87,表明其缺乏稳定性;等电点为5.63,属于酸性蛋白;不存在跨膜结构,存在35处磷酸化位点及1处糖基化位点;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占比60.69%。陆川猪MyoD1基因在背最长肌中的表达量最高,且显著高于其他组织,表达量最低的组织为肾脏。陆川猪各组织中均有MyoD1基因表达,且主要在背最长肌中表达,由此推测,MyoD1基因在陆川猪肌肉生长发育过程中可能起到至关重要的作用。

鹌鹑MyoD基因多态性与生长性状的相关性分析

[目的]研究MyoD基因与鹌鹑生长性状的相关性。[方法]以朝鲜鹌鹑为研究对象,应用HRM技术检测群体中MyoD基因的多态性,测定其生长性状,并进行关联分析;qPCR检测3种基因型胚胎肌肉组织中MyoD基因的表达量。[结果]MyoD基因在群体中存在AA、Aa和aa 3种基因型,AA和Aa基因型个体的胸围显著高于aa基因型(P<0.05)。胚胎发育的7~15 d均能检测到MyoD基因表达,MyoD基因的表达量从11 d开始升高,15 d达到峰值。AA和Aa基因型MyoD基因表达量提高速度高于aa基因型。[结论]MyoD基因A等位基因为朝鲜鹌鹑胚胎生长发育的优势基因,可用于生长发育快的个体基因型育种选择。

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。

MyoD基因对肉牛胴体性状影响的分析

用PCR技术克隆到MyoD基因的第二内含子,采用PCR-SSCP方法研究了3个黄牛品种(鲁西牛、晋喃牛、秦川牛)及4个杂交肉牛(夏洛莱×鲁西牛、安格斯×鲁西牛、利木赞×鲁西牛、西门塔尔×鲁西牛)群体MyoD基因的多态性,并分析了基因位点多态性与肉牛肉质性状的相关性。实验结果,在国内首次扩增出肉牛MyoD基因的第二内含子的全部序列,共261 bp。用SSCP方法检测到MyoD基因内含子2有A和B两个等位基因。测序结果表明该座位的多态性是由于内含子二39 bp处C-T的突变和112 bp处C→G的突变造成的。等位基因B在中国地方品种的分布频率高于引进品种的杂交牛群体。χ2检验的结果表明,在该位点的除夏洛莱和安格斯杂交牛外,其余五个群体(晋南、鲁西、秦川、西门塔尔杂交牛和利木赞杂交牛)均处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P>0.05)。实验群体不同基因型与肉牛的宰前活重、胴体重、净肉重、高档肉重、眼肌面积等性状的影响差异极显著或显著(P<0.01或P<0.05),并且AA型个体均高于AB型个体。

大口黑鲈MyoD基因结构和单核苷酸多态性位点的筛选

采用PCR技术和基因组步移技术从大口黑鲈基因组DNA中扩增得到MyoD基因及其5′调控区序列。该基因序列全长3797bp，其中5′调控区长1077bp，MyoD基因转录区由3个外显子（分别为591、81和78bp）和2个内含子（分别为1077和486bp）组成。5′调控区含有与肌肉特异性基因转录密切相关的转录调控元件Ebox、肌细胞增强因子2（MEF2）、肌肉特异性金属硫蛋白结合位点（MTBF）及一些转录反应调控元件（TATA box、OCAAT box、OCT1、PRE、AP4、Pit1）。运用PCR—SSCP技术和直接测序法进行大口黑鲈MyoD基因SNP位点筛选，结果表明MyoD基因序列中存在7个突变点，均位于内含子上。养殖群体中这7个突变点分析结果显示突变比例范围在0．042～0．353之间。本研究结果为SNPs位点与大口黑鲈生长性能关联分析奠定了基础。

山羊MyoD基因家族多态性及与体尺性状的相关性

用PCR-SSCP技术研究了波尔山羊和徐淮山羊2个群体共147个个体MyoD基因家族中3个基因座位的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。结果表明,在徐淮白山羊群体中,myf-5基因座发现有3种基因型AA、AB和BB,波尔山羊均为AA型。在myf-6基因座和myoD5′侧翼区基因座,两个山羊群体均检测到了AA和AB型个体。对山羊myf-5、myf-6基因座,myoD5′侧翼区基因座不同基因型与两品种山羊体尺性状相关分析表明,myf-5基因座对管围和管围指数的效应差异显著(P<0.05)。myf-6基因座对徐淮白山羊体尺性状的效应均不显著(P>0.05),而对波尔山羊的体高和管围指数效应差异显著(P<0.05)。两个山羊品种myoD5′侧翼区不同基因型个体的体尺性状差异均不显著。

MyoD基因在不同猪种中的分布及群体遗传结构分析

利用RFLP法检测了MyoD基因在10个中外猪种及部分杂交群体中的分布情况,分析了各群体内MyoD基因的遗传分布、遗传变异、群体杂合性等群体遗传信息,并进一步以各群体基因频率为基础,计算出群体间遗传距离和进化距离,根据进化距离对群体进行聚类,重建了系统发生树。结果表明:MyoD基因内含子1的DdeI酶切位点上不同基因型的分布在多数群体中都服从Hardy-Weinberg平衡,但在杜洛克和DLY群体中发生偏离。总体上讲,各试验群体的遗传多样性较丰富,群体遗传变异性较高,进化过程中受到自然选择压的作用,选择潜力较大。在系统发生树上,10个群体被分为4个分枝。分别是长白猪血缘、原始地方品种、杜洛克血缘和高原藏猪分枝。这一结果与各猪种的育种过程有较高的吻合性。说明部分功能基因的RFLP数据可用于近缘物种间的遗传分化研究。

不同猪品种肌肉组织FoxO1与MyoD基因mRNA的表达及其相关性分析

分别取6月龄八眉猪、长白猪和长×八杂交猪背最长肌,提取总RNA,设计并合成猪FoxO1和MyoD引物,以β肌动蛋白作为内参,优化反应条件和体系,利用RT-PCR方法检测八眉、长白和长×八杂交猪肌肉组织中FoxO1和MyoD基因mRNA的表达.结果表明,在不同经济类型猪品种肌肉组织中,FoxO1和MyoD基因mRNA的表达丰度均存在显著差异,FoxO1在八眉猪肌肉组织中的表达普遍高于长白猪(P<0.01),在杂交组合长×八肌肉组织中的表达也高于长白猪(P<0.01);而MyoD恰好相反,即在长白猪肌肉组织中的表达普遍高于八眉猪(P<0.01),在杂交组合长×八肌肉组织中的表达也高于八眉猪(P<0.01).结果提示,FoxO1和MyoD基因mRNA的表达在肌肉发育中存在负相关(r=0.728,P<0.05),FoxO1在肌肉组织中的上调作用,可能是造成的MyoD基因mRNA表达降低的原因之一,进而负调控肌肉的发育和骨骼肌的量.

鸭胚胎发育早期MyoD和MSTN的表达变化规律

文章旨在对肌肉生长具有反向调控的两个关键基因Myo D和MSTN在鸭胚胎早期的表达模式进行探讨。采用实时荧光定量PCR方法对金定鸭8、8.5、9、9.5、10、11、12日胚龄脑部、肝脏以及腓肠肌中Myo D和MSTN m RNA表达量进行定量,并分别对两个基因的表达水平在组织之间、胚龄之间的变化规律进行分析,并对两个基因之间的相关性进行研究。结果表明,在脑组织、肝脏、腓肠肌中,Myo D和MSTN基因表达水平均在腓肠肌中最高。Myo D和MSTN基因9.5胚龄时均在脑组织中有一个表达小高峰;在8胚龄到12胚龄的发育中,腓肠肌中的Myo D、肝脏中的MSTN表达水平均无显著变化,且在8~12胚龄Myo D和MSTN基因均是在腓肠肌中表达量最高。脑组织和腓肠肌中的两基因表达量均呈极显著的正相关。结果显示,金定鸭胚胎期脑组织、肝脏、腓肠肌均能表达Myo D和MSTN基因,且腓肠肌中表达量均高于脑组织和肝脏,两基因对3个组织生长发育的协调关系可用Myo D/MSTN表达量比值表示。

成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程的动态变化

目的探讨成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态表达。方法用盐酸布比卡因局部注射制作肌肉损伤模型,在损伤后不同时间点取腓肠肌行冰冻切片,HE染色显示损伤肌肉的病理变化,用SABC法检测MyoD与myogenin的表达。结果MyoD在肌肉损伤后18 h开始表达,48 h达高峰;myogenin在肌肉损伤后24 h开始表达,72 h达高峰。结论MyoD与myogenin在肌肉损伤后的再生修复过程中起作用,可作为鉴定肌肉前体细胞和反映肌肉再生的指标。

南阳黄牛肌肉发育过程中的MyoD和MEF2基因的表达变化研究

利用荧光实时定量PCR技术分析了南阳黄牛3月龄到24月龄间背最长肌组织中MyoD和MEF2基因家族的表达变化情况.结果表明,MyoD基因的表达呈先升高后降低的趋势,在18月龄时表达量最高.MEF2A基因在3月龄时表达量最低,在12月龄和18月龄时表达量显著升高,随后表达量下降;MEF2B基因的表达呈持续上升趋势;MEF2C基因在3月龄时表达量最低,在肌肉发育过程中表达量变化比较小;MEF2D基因表现出明显的先升高后降低趋势,18月龄和24月龄时的表达量比3月龄时显著高.

关岭牛MyoDⅠ基因启动子报告质粒的构建及活性验证

为了克隆关岭牛MyoDⅠ基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoDⅠ基因序列设计PCR引物,用PCR技术扩增牛MyoDⅠ基因的启动子,构建重组克隆载体pUCmT-MyoDⅠ;并通过PCR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴定;构建报告质粒pGL3-MyoDⅠ,并将其转染小鼠C2C12、3T3-L1细胞系,检测其24h后的双荧光素酶活性。实验结果获得了关岭牛MyoDⅠ基因启动子,其序列长度为993bp,并成功构建了MyoDⅠ启动子报告质粒;双荧光素酶活性检测表明pGL3-MyoDⅠ在小鼠C2C12细胞中的表达是pGL3空载体40.65倍,在小鼠3T3-L1细胞中的表达是空载体的1.13倍,MyoDⅠ启动子在小鼠C2C12细胞中的表达高于3T3-L1细胞(**p<0.01)。结果表明关岭牛MyoDⅠ基因启动子具有启动活性,在小鼠骨骼肌细胞中特异性表达。

MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的实验研究

目的:探讨MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的可能性。方法:将MyoD基因重组腺病毒载体转染大鼠心脏成纤维细胞,观察转染后大鼠心脏成纤维细胞形态的变化;用RT-PCR和Westernblot方法检测MyoD和肌细胞生成素的表达;免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白的表达。结果:MyoD基因转染后的大鼠心脏成纤维细胞形态和排列方式发生明显变化;RT-PCR可检测出转染后细胞表达MyoD;Westernblot结果表明转染后细胞表达MyoD和肌细胞生成素;免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白表达均为阳性。结论:MyoD基因可诱导体外培养的大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞,为进一步研究MyoD对心肌损伤的修复作用奠定了基础。

成肌调节因子MyoD和Myf-5在人体失神经骨骼肌中的表达及其临床意义

目的 研究人体骨骼肌失神经支配后成肌调节因子MyoD和Myf 5蛋白的表达变化 ,了解骨骼肌的再生状态。方法 2 0例不同时间人体失神经骨骼肌与 3例正常骨骼肌标本 ,HE染色和透射电镜观察肌卫星细胞形态变化 ;抗MyoD和Myf 5多克隆抗体免疫组织化学染色 (ABC法 ) ,统计阳性染色细胞核数。 结果 抗MyoD和Myf 5抗体阳性染色细胞核数在人体骨骼肌失神经 1～ 2月时的肌卫星细胞中最多 ;3个月后急剧下降 ,并维持在一低水平 ;1年后几乎无表达。结论 人体骨骼肌失神经支配后早期肌卫星细胞通过MyoD和 (或 )Myf 5途径激活。

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白(ehanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTMLTX转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1的开放阅读框(ORF)两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418(400μg.mL-1)筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。

急性骨骼肌钝挫伤修复过程及MyoD、Myogenin变化的实验研究

目的:观察小鼠急性骨骼肌钝挫伤后骨骼肌动态修复过程,探讨伤后Myo D和Myogenin的作用。方法:以雄性C57BL/6小鼠为研究对象,制作腓肠肌钝挫伤模型,分为正常对照组和损伤后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d组。经HE染色和Masson三色染色观察骨骼肌钝挫伤后再生和纤维化瘢痕愈合过程;经免疫蛋白印迹法与免疫组织化学法检测Myo D和Myogenin定量与定位表达变化。结果:(1)骨骼肌钝挫伤后3 d首次观察到新生肌细胞核,伤后5 d开始出现胶原纤维。(2)MyoD伤后1 d表达至高峰,随后下降,伤后14 d再次表达至第2高峰;MyoD阳性细胞核由正常肌细胞边缘逐渐迁移至受损骨骼肌周围聚集。(3)Myogenin伤后3 d开始表达至高峰;Myogenin阳性细胞核伤后3 d首次出现在新生成肌细胞核上,伤后5 d在新生肌管中表达,伤后7 d逐渐迁移至新生肌细胞边缘表达。结论:骨骼肌急性钝挫伤后MyoD和Myogenin表达具有时间规律性,新生肌纤维和纤维化共同完成骨骼肌钝挫伤后的愈合过程。

MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究

目的 探讨MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞 (MSCs)分化为成肌细胞的可能性。方法 利用脂质体转染方法 ,将真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2 EGFP MyoD转入MSCs中 ,G418筛选 ;用RT PCR检测MyoD的表达 ,扩增产物纯化测序鉴定 ;荧光显微镜和激光共聚焦观察报告基因产物 ;免疫组化检测MyoD、myogenin、myosin、myoglobin、desmin的表达 ;电镜观察转染前后细胞超微结构的变化。结果 RT PCR可检测出转染后细胞表达MyoD ,扩增产物纯化测序与GeneBank比较完全一致 ;荧光显微镜和激光共聚焦观察均可见绿色荧光 ;免疫组化检测MyoD、myogenin、myosin、myoglobin、desmin表达均为阳性 ;转染后的MSCs观察表现为较为成熟细胞的形态学特点 ,且胞浆中有丝状物结构。结论 MyoD基因可成功诱导体外培养的骨髓MSCs分化为成肌细胞 。

草鱼MyoD基因SNP和Indel标记的筛选及其与生长性状的关联分析

为探索MyoD基因多态性对草鱼(Ctenopharyngodon idella)生长性状的影响,采用PCR产物直接测序的方法,检测草鱼MyoD基因上的突变位点,并分析其与草鱼生长性状的相关性。结果表明:在草鱼MyoD基因上筛选到4个多态性高、分型稳定的突变位点,即M1(940后T碱基的插入)、M3(1630后重复单元AATAGCCT的缺失)、M4(G1669A)和M5(A1681T)。M1位点不同基因型个体间的体长、全长、尾柄长和尾柄高存在显著差异(P<0.05),纯合缺失基因型(DD)显著大于纯合插入基因型(TT);M3和M4位点不同基因型个体间的生长性状差异均不显著(P>0.05);M5位点不同基因型个体间的体质量、体宽、体高和眼间距存在显著差异(P<0.05),优势基因型为TT。MyoD基因的M1和M5突变位点可作为草鱼选育的候选分子标记。

大负荷运动后不同时相大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD、myogenin表达的变化

目的:研究力竭游泳运动及恢复期大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD、myogenin蛋白表达的变化,以进一步探讨运动导致的骨骼肌微损伤后的再生修复机制。方法:36只8周龄健康雄性SD大鼠随机分为安静对照组(C)、力竭运动后即刻组(E0)、力竭运动后12h组(E12)、力竭运动后24h组(E24)、力竭运动后48h组(E48)和力竭运动后72h组(E72)6组,每组6只。各力竭运动组进行为期1周的负重力竭性游泳运动,并于末次力竭运动后不同时间点取样。采用SABC-DAB免疫组化方法检测大鼠比目鱼肌和股外侧肌中成肌调节因子MyoD、myogenin蛋白表达。结果:C、E0、E12组大鼠比目鱼肌和股外侧肌未见MyoD与myogenin蛋白表达;E24组比目鱼肌MyoD有一定数目的表达,E48组表达数目较多,E72组有所降低,但仍多于E24组;E24组比目鱼肌myogenin有少量表达,E48组表达量也较少,但比E24组多,E72组表达数目明显增多。阳性细胞核数目(均数/视野)统计结果为:C、E0、E12组比目鱼肌MyoD均为0;E24:7.6个/视野;E48:22.2个/视野(较多);E72:13.1个/视野;C、E0、E12组比目鱼肌myogenin均为0;E24:2.0个/视野;E48:3.2个/视野;E72:12.0个/视野(较多)。大鼠股外侧肌MyoD、myogenin表达趋势与比目鱼肌基本一致。结论:力竭游泳运动及恢复期不同时相,大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD、myogenin蛋白表达呈规律性变化,大鼠比目鱼肌和股外侧肌MyoD蛋白表达量在大负荷运动后48h较高,myogenin蛋白表达量在大负荷运动后72 h较高。

MyoD1、Myogenin在儿童横纹肌肉瘤中的表达及其临床意义

目的:探讨MyoD1、Myogenin在儿童横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarmma,RMS)及其他3种儿童小细胞恶性肿瘤中的表达情况及其临床意义。方法:选取胚胎型横纹肌肉瘤(Embryonal rhab domyosarcoma,ERMS)11例,腺泡型横纹肌肉瘤(Alveolar rhab domyosarcoma,ARMS)5例,神经母细胞瘤、恶性淋巴瘤、尤文肉瘤各10例,行HE染色,并应用S-P免疫组织化学染色法检测MyoD1、Myogenin蛋白在这4种儿童小细胞恶性肿瘤中的表达水平。结果:MyoD1、Myogenin在RMS中阳性表达率分别为7:5%,68.75%,在其他3种肿瘤中阳性表达率均为0%,MyoD1、Myogenin在RMS组中的表达与其他肿瘤组比较差异有统计学意义(P<0.05),2种蛋白在ARMS中的阳性表达率明显高于ERMS(P<0.05),其恶性程度越高,MyoD1和Myogenin阳性表达越强(P<0.05)。MyoD1、Myogenin在预后差组中的阳性表达率明显高于预后中组(P<0.05)。结论:MyoD1、Myogenin可以作为辅助鉴别RMS及其他小细胞恶性肿瘤的依据;MyoD1、Myogenin基因可以作为辅助诊断儿童RMS的综合指标,也可作为鉴别儿童ERMS和ARMS有用的分子生物学标志;检测儿童RMS中MyoD1、Myogenin的表达情况对RMS恶性程度及预后的判断有一定的临床指导意义。