射血分数保留的心力衰竭患者血清Myostatin、DLL1与心室重构指标和预后的关系研究

目的探讨射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)患者血清肌肉生长抑制素(Myostatin)、Delta样缺口配体1(DLL1)与心室重构指标和预后的关系。方法选取2021年1月至2022年1月该院收治的117例HFpEF患者为HFpEF组,另选取同期100例体检健康者为对照组。比较HFpEF组与对照组血清Myostatin、DLL1水平和心室重构指标[左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室后壁厚度(LVPWT)、舒张末期室间隔厚度(IVST)、左心室心肌质量指数(LVMI)]。采用Pearson相关性分析HFpEF患者血清Myostatin、DLL1与心室重构指标的相关性。根据随访1年的预后状况,将HFpEF患者分为预后不良组和预后良好组。采用多因素Logistic回归分析HFpEF患者预后不良的影响因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Myostatin、DLL1水平对HFpEF患者预后不良的评估价值。结果HFpEF组血清Myostatin、DLL1水平及LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI均高于对照组(P<0.05)。HFpEF患者血清Myostatin、DLL1与LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI均呈正相关(P<0.05)。随访1年后,HFpEF患者预后不良发生率为33.33%(39/117)。多因素Logistic回归分析显示,纽约心脏协会(NYHA)心功能分级≥Ⅲ级、有高血压和LVEDD、N末端B型利钠肽前体(NT-proBNP)、Myostatin、DLL1升高为HFpEF患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清Myostatin联合DLL1预测HFpEF患者预后不良的曲线下面积高于各指标单独预测。结论HFpEF患者血清Myostatin、DLL1水平升高,且与心室重构加重和预后不良有关。血清Myostatin、DLL1联合检测对HFpEF患者预后不良具有较好的评估价值。

鸡Myostatin基因单核苷酸多态性的群体遗传学分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子 ,采用PCR SSCP和测序的方法发现了 5个位于Myostatin基因 5′-和 3′ -调控区的单核苷酸多态性位点 ,对北京油鸡、白耳鸡、石歧杂、矮小黄鸡、小型黄鸡、惠阳胡须鸡、隐性白羽鸡、海兰、AA鸡等不同鸡种的该单核苷酸多态性分析结果表明 :Myostatin基因的 5′调控区引物P6 0 P6 1扩增片段多态性是由 3个核苷酸的改变而产生的 [分别是G→A(30 4位 )、A→G(32 2位 )、C→T(334位 ) ],引物P93 P94扩增片段的多态性是由G→A(16 7位 )突变造成的 ,引物P117 P118PCR扩增片段多态性是由T→C(177位 )造成的。 3′调控区引物P80 P81扩增片段多态性是由第 72 6 3位A突变为T造成的 ,引物P76 P77扩增片段多态性是由A→G(6 935位 )造成的。不同鸡种群体遗传学分析表明 ,5′ -调控区引物P6 0 P6 1扩增片段多态性位点在北京油鸡的基因型频率分布与其他的品种有很大的差异 ,其BB基因型频率为 0 70 0 ,AA基因型频率仅为 0 0 33,而其他鸡种中以A基因占优势 ;对于引物P93 P94 ,品种间的基因型频率差异极显著 (P <0 0 1) ,北京油鸡和AA鸡的EE型频率低于其他品种 ,白耳鸡和海兰蛋鸡中以EE型为主 ,其频率高于其他品种 ;3′ -调控区引物P80 P81多态性位点在 9个鸡种中?

鸡Myostatin基因单核苷酸多态性及其对屠体性状的遗传效应分析

以180只3个品系的温岭草鸡为材料,采用PCR-RFLP方法对鸡MSTN基因外显子1的2个多态位点进行研究,并分析对屠体性状的遗传效应。Bsh1236Ⅰ识别G(2100)A突变,产生MN和NN2种基因型,MspⅠ识别G(2109)A突变,产生AA、AB和BB3种基因型,联合2个位点分析出现了5种基因型。基因型频率在品系间的χ2检验表明差异均不显著(P>0.05)。方差分析显示不同基因型的屠宰率有显著或极显著的差异(P<0.01或P<0.05)。多重比较显示:杂合型MN的腹脂重和屠宰率显著(P<0.05)高于突变型NN;杂合型AB的胸肌重和胸肌率显著(P<0.01或P<0.05)高于基因型AA,基因型AA的腹脂重和腹脂率都极显著(P<0.01)高于突变型BB,在腿肌重性状上,BB型显著(P<0.05)低于AA型和AB型;2个位点联合分析时,NA/MA基因型的腹脂重、腹脂率和胸肌率均极显著(P<0.01)高于或低于其他基因型。

利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育,牛MSTN基因突变会出现"双肌"特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因,获得敲除MSTN基因的细胞系,为制备MSTN基因敲除牛提供材料。构建一对MSTN基因的TALENs真核表达载体,分别采用PEI转染试剂和电穿孔法进行牛胎儿成纤维细胞的转染,测序结果表明TALEN技术可用于敲除牛MSTN基因,利用T7核酸内切酶1(T7E1)检测其突变效率,结果显示电穿孔转染的敲除效率为20.4%。通过有限稀释法,共获得10个MSTN基因敲除的细胞克隆(包括MSTN-/-和MSTN+/-),其靶位点敲除的碱基数分别是1～20不等,部分会出现移码突变。出现移码突变的细胞系可用于MSTN基因敲除的转基因肉牛的制备。

牛Myostatin基因单核苷酸多态性分析

Myostatin基因即肌肉生长抑制素,是一种肌肉生长的负调控因子。应运PCR-SSCP和测序的方法对中国秦川牛、南阳牛以及国外引入品种皮埃蒙特牛双肌基因的第三外显子进行了多态性分析。结果表明:第三外显子938处G→A的单核苷酸的突变造成了南阳牛、皮埃蒙特牛第三外显子扩增片段多态性,秦川牛则不然。

进行性肌营养不良患者Myostatin基因的表达分析

进行性肌营养不良是一组以进行性骨骼肌萎缩和无力为特征的肌源性肌病。肌肉抑制素(Myostatin)是最近发现的骨骼肌生长发育抑制因子。为探讨Myostatin基因与进行性肌营养不良病理发生的相关性,采用RTPCR方法克隆了患者的Myostatin基因并测序、分析肌营养不良患者是否存在Myostatin基因突变;然后采用半定量RTPCR方法检测患者中Myostatin基因的表达水平是否发生改变,同时用Westernblot方法分析了肌营养不良患者中Myostatin蛋白的表达情况。结果发现,所研究的肌营养不良患者中没有携带Myostatin基因突变,但一些患者的Myostatin基因转录水平降低,部分患者Myostatin蛋白加工障碍。结果提示,一些类型(亚型)的进行性肌营养不良可能与肌肉抑制素Myostatin基因表达异常、蛋白加工障碍有关。

家鹅Myostatin基因3-′UTR序列分析

利用家鹅Myostatin基因第3外显子设计上游引物、家鸡Myostatin3-′UTR设计下游引物,PCR扩增并克隆出家鹅该基因3-′UTR长1 064bp DNA序列。该序列具有一个polyA加尾信号序列(TAATAAA),并富含连续的TTTT高保守区。分析家鹅与其他12个物种该序列的同源性发现,其与家鸡的同源性最高,达87.1%,与鱼类的最低(<11%)。以13个物种Myostatin3-′UTR构建的分子进化树表明,3′UTR能够为动物进化提供一定信息,但适用于较低分类阶元。

Myostatin重组蛋白疫苗对小鼠骨骼肌质量和力量的影响

目的:探讨Myostatin重组蛋白疫苗(His-Ms)对小鼠骨骼肌质量和力量的影响及其相关机制。方法:实验动物分为正常对照组和His-Ms组,每组10只。采用基因工程技术表达并纯化的Myostatin无活性蛋白作为疫苗,按100μg/只剂量对His-Ms组小鼠进行免疫,每隔14 d免疫1次,免疫4次,共62 d。在His-Ms组小鼠进行免疫时,正常对照组腹腔注射相等体积生理盐水。最后一次免疫后20 d对照组和His-Ms组动物取血样和组织样本,检测血清Myostatin抗体水平及胆固醇(CHO)、甘油三脂(TG)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、肌酸激酶(CK)等血液指标,检测骨骼肌质量和细胞形态等指标。结果:利用高纯度His-Ms重组蛋白作为疫苗免疫小鼠,可诱导小鼠产生特异性抗体,平均抗体滴度在2×102以上。血清中CHO、TG、BUN、GLU和CK等指标两组小鼠间无显著性差别。与正常对照组比较,His-Ms组免疫小鼠体重平均增加了3.6%;股四头肌、腓肠肌和胸大肌重量分别增加了11.2%、3.2%和15.8%,股四头肌横断面积增加了5.6%,而每束肌纤维平均细胞数两组之间无明显差别。His-Ms组免疫小鼠前肢抓力与正常对照组比较平均增加了26.6%,增加显著(P<0.05)。结论:Myostatin重组蛋白疫苗免疫使小鼠体重和肌肉质量不同程度增加,抓力明显增强。

赤眼鳟myostatin基因的克隆与组织表达分析

以赤眼鳟(Squaliobarbus crriculus)肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE方法,获得其myostatin(肌肉生长抑制素)基因全长为2 214 bp的cDNA序列,其包含了1个含有1 128个核苷酸的开放性阅读框(ORF),共编码375个氨基酸。赤眼鳟与其他物种myostatin的特征性一致。其编码区序列与鲤鱼同源性最高,为96.99%,与其他鱼类的同源性为76%～81%,与哺乳类和鸟类的同源性较低,为63%左右。赤眼鳟Myostatin蛋白的氨基酸序列与其他物种同源性较高,尤其在C端生物活性区,高度的保守性反映了该基因受到了高度的进化限制以及功能的重要性。半定量RT-PCR分析表明,myostatin基因在除肝脏外的其他组织都有表达,在肌肉和脑中的表达量较高,此结果表明赤眼鳟myostatin基因除了对肌肉生长发育有调控作用以外,还可能在机体中发挥其他功能。

siRNA阻断鼠成肌细胞myostatin表达对细胞增殖及分化能力的影响

目的研究myostatin表达被阻断后鼠成肌细胞的增殖及分化能力。方法构建可阻断myostatin表达的siRNA表达载体,并转染鼠成肌细胞,用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹鉴定myostatin表达。培养myostatin表达被阻断的成肌细胞,计数不同时间的细胞数和测定细胞表达的肌酸激酶。使用诱导分化培养液培养myostatin表达被阻断的成肌细胞,观察其分化成肌管的能力。结果 siRNA表达载体对成肌细胞myostatin表达的干扰率为81.6%,其干扰效果也被Western印迹所证实。Myostatin表达被阻断的成肌细胞数目增加(P<0.05),细胞内肌酸激酶活力升高(P<0.05)。正常成肌细胞培养7 d可分化成肌管,myostatin表达被阻断后需10 d才分化成肌管。结论 siRNA表达载体阻断成肌细胞的myostatin表达后细胞的增殖能力增强,分化被延迟,或许可成为治疗肌肉萎缩的一种新途径。

鹅Myostatin基因编码区核苷酸多态性研究

利用鹅Myostatin基因3个外显子设计4对引物,分析扬州鹅、皖西白鹅和五龙鹅3个品种鹅的Myostatin基因编码区的单核苷酸多态性。结果表明:鹅该基因编码区高度保守,仅第3外显子的第263 bp处检测到由A→C的单碱基"沉默"突变,该突变位点仅检测到AA、AB 2种基因型,且杂合子频率极低(2.5%),皖西白鹅群体未能检测到AB型个体。对五龙鹅群体的初步分析发现,AB型个体具有较高的产肉性能,但因所检测到的杂合子个体数较少,故该位点各基因型与生产性能间的关系有待于进一步研究证实。

猪myostatin基因5’调控区的酶切多态性分析

用 PCR- RFLPs分析方法 ,对长白、大白、杜洛克、军牧 号、民猪 5个猪种的 myostatin基因 5’调控区进行了酶切多态性分析。结果表明 ,长白、大白、杜洛克以等位基因 T为主 ,检测的 4 0头军牧 号的等位基因全部是 T,民猪 3种基因型均有 ,且频率近乎相等。统计分析表明 ,3种基因型的分布在长白、大白、杜洛克、军牧 号间差异不显著 ,而民猪同这

Myostatin在小鼠腓肠肌失神经支配萎缩过程中的表达

目的:分析myostatin在腓肠肌失神经支配萎缩过程中的表达变化及其在肌萎缩过程中的作用。方法:采用坐骨神经横断术制备小鼠腓肠肌失神经支配模型,实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测失神经支配不同时段腓肠肌myostatin mRNA和蛋白表达水平,并对失神经前后肌肉湿重比、肌纤维横截面积进行比较。结果:失神经支配1 d时,腓肠肌myostatin mRNA迅速上升,3 d达到高峰,随后逐渐下降,而相应蛋白水平逐渐增高,7 d达到高峰继而逐渐下降,至56 d时mRNA和蛋白水平仍略高于正常水平。结论:腓肠肌失神经支配萎缩过程中myostatin的表达变化是一重要的分子事件。

3个黄牛品种的myostatin 5′调控区多态与生长性状的相关分析

用PCR-RFLPs方法对南阳牛、秦川牛、郏县红牛3个品种共411个个体的myostatin5′调控区的单核苷酸多态性(SNPs)进行分析。结果表明,3个品种在myostatin5′调控区T→A突变以等位基因T为主,仅在郏县红牛中发现1个AA型纯合体,郏县红牛品种显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05),其它品种处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。对黄牛myostatin5′调控区T→A突变与南阳牛、秦川牛和郏县红牛生长性状进行相关分析,结果显示,TT型南阳牛6月龄的胸围和胸围指数显著低于TA型个体,TT型南阳牛18月龄的体高显著高于TA型个体(P<0.05),但基因型对秦川牛和郏县红牛生长性状的效应不显著(P>0.05)。提示在南阳牛的育种实践中应该综合考虑南阳牛生长阶段和所要选择的性状。

肌抑素(Myostatin)基因突变体活性区的克隆、表达及活性的研究

肌抑素Myostatin是肌肉发育的重要抑制因子 ,肌抑素的突变 ,使其抑制功能的全部或几乎全部丧失 ,表现为肌肉细胞的增大和肌纤维束的增加。采用PCR技术 ,从肌抑素天然突变的双肌牛皮尔蒙特 (Piedmontese)的基因组中扩增得到肌抑素突变体的活性区 ,并将其亚克隆到pMD18 T载体上 ,利用基因重组技术 ,构建原核表达质粒pET3 0a(+ ) action Myostatin ,在大肠杆菌中高效表达 ,采用亲和层析法纯化表达产物 ,并将其共孵育于离体培养的绵羊肌肉细胞 ,检测肌抑素突变体的生化活性 。

Myostatin基因5′调控区的多态与猪生长性能的关系

采用PCR-RFLP技术对45头金皮(金华猪×皮特兰猪)F2代猪Myostatin基因5′调控区的多态性进行检测,根据酶切结果将其分为AA、TT和AT 3种基因型,结果显示A等位基因频率为0.467,T等位基因频率为0.533。对这些个体进行生长和屠宰性能测定以及对背最长肌进行免疫组化分析,进而采用SPSS程序分析Myo-statin不同基因型对金皮F2代猪生长性状、肌纤维组织学特性及胴体性状的影响。结果表明:Myostatin基因对金皮F2代猪肌纤维直径、MHC I型肌纤维比例、肩部背膘厚、眼肌肉色亮度及出生至4月龄平均日增质量的影响均达到显著水平(P<0.05)。

3品种鹅Myostatin基因3′-调控区SNPs群体遗传学分析

利用已测得的鹅Myostatin基因3′-调控区核苷酸序列设计5对PCR-SSCP引物,对扬州鹅、皖西白鹅以及五龙鹅3品种家鹅该区域内单核苷酸多态性进行了分析,并探索了单核苷酸多态性与生产性能之间的关系。结果表明,检测到A→G(88位)和G→T(353位)2个单碱基突变位点。88位处,E等位基因为优势等位基因,具有EE、EF两种基因型,以扬州鹅杂合子频率最高(0.550),皖西白鹅30个个体仅有一例EF型;353位处,G为优势等位基因,具有GG、GH和HH 3种基因型,3品种均具有较高的GG基因型频率、较低的HH基因型频率。屠体性能分析发现,EF基因型家鹅具有更高的屠体性能;扬州鹅、皖西白鹅GG型个体的腿肌重和腿肌率显著高于HH型个体(P<0.05),五龙鹅腿肌重、腿肌率具有GG型(GH型(HH型的趋势,但差异不显著(P>0.05)。

Myostatin通过Smad3下调MyoD的表达来抑制骨骼肌卫星细胞的分化

Myostatin基因,是肌肉生长的负调控因子,通过下调MyoD的表达抑制骨骼肌细胞的分化,但具体机制目前尚未完全清楚。以体外培养的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料,利用RNA i技术,以Smad3为靶基因进行干扰研究,研究干扰前后猪骨骼肌卫星细胞增殖情况的变化以及MyoD、Myostatin基因的表达规律,进一步阐述3个基因间的调控关系。结果表明,Myostatin通过下调MyoD的表达,抑制骨骼肌卫星细胞的分化,但这种抑制作用是受Smad3调节的。

Myostatin基因疫苗动物免疫效果的初步研究

目的:检测Myostatin基因疫苗的免疫效果,观察其对免疫动物的影响,为Myostatin基因疫苗的应用提供实验研究。方法:以Myostatin基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫小鼠,ELISA法测定其免疫小鼠血清的抗体滴度,通过全自动生化分析仪检测血清指标。以组织化学染色(HE)染色检测Myo-statin基因疫苗对免疫小鼠骨骼肌的影响。利用Scion Image4.02分析Myostatin基因疫苗对免疫小鼠肌纤维横截面积的影响。结果:基因疫苗Myostatin能够诱导小鼠产生针对Myo-statin的抗血清。与正常对照组比较,基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫的动物平均体重增加了9.8%,股四头肌、腓肠肌和胸大肌分别增加了24.1%、10.9%和20.3%。结论:基因疫苗Myostatin能够诱导小鼠产生针对Myostatin的特异性中和抗体。Myostatin基因疫苗免疫的动物体重增加,肌细胞有肥大现象,肌肉质量明显增加。

Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Myostatin基因的敲除

目的:用缺口修复等技术构建Myostatin(肌肉生长抑制素,MSTN)基因打靶载体,并对大白猪胎儿成纤维体细胞进行转染,获得基因敲除细胞。方法与结果:首先构建用于MSTN基因同源长臂(LA)的抓捕载体,然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复,从含大白猪MSTN基因座的细菌人工染色体上亚克隆9.9 kb的LA到抓捕载体上,经过部分序列测定,同源性为100%;通过PCR获得1.4 kb的同源短臂(SA);将LA和SA连入载体pLOXP,构建含有neo和tk正负筛选标记基因的MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN-KO;将线性化的pLOXP-MSTN-KO通过电转染整合到大白猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和丙氧鸟苷进行药物筛选,获得抗性细胞克隆890个,通过PCR和DNA测序鉴定获得基因敲除的细胞克隆4个。结论:构建了有效的MSTN基因打靶载体,通过转染获得基因敲除细胞,为利用体细胞核移植制备MSTN基因敲除猪奠定了基础。