鱼类鼻黏膜相关淋巴组织的研究进展

鱼类黏膜相关淋巴组织是抵御病原入侵的第一道防线。其中,鱼类鼻黏膜相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)近年来被国内外学者所关注,并被证明是嗅觉器官中抗原识别和启动黏膜免疫应答的重要场所,在细菌、病毒和寄生虫感染后可发挥快速的局部免疫响应。以NALT为靶点,对鱼类开展疫苗鼻内接种可起到良好的免疫保护效果。但目前,对NALT中复杂的免疫细胞与分子网络及其互作机制知之甚少。本文对鱼类嗅觉器官结构与功能、NALT的细胞与分子网络及免疫应答、鼻内接种的应答及免疫保护效果等方面的最新研究进展进行综述,旨在阐明鱼类NALT在黏膜局部发挥的免疫防御机制,以期为新型黏膜疫苗的设计与研发提供参考。

鸡鼻腔组织学特点及鼻相关淋巴组织分布的研究

旨在通过组织学方法对鸡鼻腔结构组织特点以及鼻相关淋巴组织的分布进行系统研究。选用25只3日龄白来航鸡,分别于10、21、35和60日龄宰杀,分离整个鼻腔。经波恩液固定48h后,一部分鼻腔组织沿矢状面和横断面切成连续断面,实体显微镜下观察解剖学结构;一部分用于组织学结构观察:固定后,10日龄雏鸡的鼻腔直接进行石蜡包埋,21日及以上日龄的鸡鼻腔先用甲酸脱钙再石蜡包埋。所有鼻腔沿纵轴选取5个横断面进行连续切片和HE染色。结果发现,鸡鼻腔的大部分空间被鼻甲所占据。鸡鼻腔前部主要分布为复层扁平上皮;中部逐渐过渡为假复层柱状纤毛上皮,在纤毛上皮下可见大量由杯状细胞构成的分泌腺;后鼻甲部位主要分布着由单层细胞构成的嗅上皮。在鸡鼻腔的中后部,中鼻甲的底部和鼻后口两侧分布有鼻相关淋巴组织。此外,在中鼻甲和鼻腔周壁黏膜上皮下还随机分布一定数量的弥散淋巴组织。说明鸡鼻腔中分布有丰富的鼻相关淋巴组织,提示鸡鼻腔中后部为鼻腔免疫的主要投递位点和诱导位点。

鸡鼻黏膜及其淋巴组织发育的组织学观察

为了观察不同日龄鸡鼻黏膜及其淋巴组织(NALT)的形态结构,从而了解其不同时期的免疫状态。选择不同日龄的鸡胚和雏鸡,每个时期取3只鸡胚或雏鸡的鼻组织制成冰冻切片,片厚5μm,然后进行H.E.染色。结果发现,胚胎18日龄即可辨认鼻腺结构;出壳后1日龄时,鼻内黏膜形态结构发生变化,表面形成假复层柱状纤毛上皮;7日龄时,鼻泪管口处首先出现淋巴集合体(NALT);21日龄时,鼻后孔处呼吸黏膜中也形成了发达的NALT,且初次发现淋巴小结,此外在鼻甲黏膜中也形成明显的NALT;35日龄时,鼻黏膜厚度显著增加,几乎达到成熟水平,鼻腺管周围也出现NALT,而且在鼻腺管上皮下存在大量弥散性淋巴细胞。表明鸡鼻黏膜以及NALT的组织结构随着日龄增长逐渐发育成熟,并在35日龄时基本达到成熟水平。

鼻腔免疫研究进展

鼻腔免疫能避免肝脏的首过效应,有效地诱导粘膜局部免疫和系统免疫应答,具有远端共同粘膜效应,比其它免疫途径更简便、更安全,成为当今疫苗研究的重点方向之一。本文综述鼻腔免疫应答的细胞和分子机理、抗原释放系统及佐剂等方面的最新研究进展。

HIV-1_(CN54)合成gp120基因(syngp120)的DNA疫苗鼻内免疫小鼠诱导全身的和粘膜的免疫应答

目的 初步探讨HIV-1CN54合成gp120基因的DNA疫苗（pcDNA3.1-syngp120）鼻内接种小鼠是否诱发免疫应答。方法 DNA疫苗免疫后,制备脾和肠系膜淋巴结（MLN）淋巴细胞,在体外测其增殖应答和CD8+CTL应答。间接ELISA法测血清和粘膜洗液抗原-特异的IgG和IgA抗体滴度。中和实验测免疫血清和阴道洗液是否中和 HIV-1SF33。结果 在 DNA疫苗未次免疫后,小鼠第 1周检测到脾和 MLN CD8+CTL应答较弱,而第 5周未检测到。另外,在末次免疫后的第1、5周检测到MLN而未检测到脾淋巴细胞发生增殖应答。并且检测到特异的血清IgG抗体和粘膜的（包括粪便和阴道洗液）IgA抗体,但未检测到血清的IgA抗体和粘膜的（包括粪便和阴道洗液）IgG抗体。中和实验发现末次免疫后第5周的血清能中和实验室毒株HIV-1SF33（B亚型）,而阴道洗液则没有。结论 该DNA疫苗鼻内免疫小鼠可诱导粘膜免疫应答,包括 MLN淋巴细胞增殖应答和 CD8+CTL应答,同时诱导较弱的粘膜IgA抗体应答。此外,能诱导脾CD8+CTL应答和血清IgG抗体应答。免疫血清中和HIV-1S F33,而阴道洗液不能。

Orai1蛋白体外干预对小鼠nuocyte细胞功能的影响

目的探讨nuocyte细胞是否表达Orai1蛋白及该蛋白的功能。方法用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)建立小鼠变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)模型,计数AR小鼠的打喷嚏、挠鼻次数,分离、提纯并体外培养AR小鼠鼻相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)中的nuocyte细胞,用激光扫描共聚焦显微镜定性检测该细胞Orai1蛋白的表达,以ELISA法和实时荧光定量RT-PCR法分别定量检测该细胞Orai1蛋白及其mRNA的表达量,将小鼠重组(recombinant,rm)白介素(interleukin,IL)-33加入nuocyte细胞培养基,检测其中IL-5和IL-13蛋白及其mRNA的浓度,然后再将Orai1蛋白抗体加入nuocyte细胞培养基,再次检测其中IL-5和IL-13蛋白及其mRNA的含量。结果小鼠AR模型打喷嚏和挠鼻次数较正常小鼠显著增多,OVA诱导NALT来源的小鼠nuocyte细胞被鉴定为CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1(lineage)-ICOS+,该细胞表面表达Orai1蛋白,其蛋白和mRNA含量均较正常小鼠显著升高,rmIL-33加入nuocyte细胞培养基后,IL-5和IL-13蛋白及其mRNA的浓度均明显增多,而加入Orai1蛋白抗体后,其浓度出现下降。结论 nuocyte细胞表达Orai1蛋白,该蛋白的干预抑制nuocyte细胞的正常功能。

黏膜相关淋巴组织介导的IgA肾病发病机制及治疗进展

IgA肾病(IgAN)是世界上非常常见的原发性肾小球疾病,不同种族的患病率存在差异,其发病机制目前尚不明确,也无特异性治疗。近期研究表明IgAN与黏膜免疫密切相关。本文对IgAN黏膜发病机制的种族异质性及目前针对黏膜免疫的IgAN治疗进行综述,重点阐述鼻咽相关淋巴组织(NALT)和肠黏膜相关淋巴组织(GALT)在IgAN中发病机制的研究和相关治疗的新进展。

鼻黏膜免疫佐剂提高疫苗免疫效应的作用机制及进展

大量研究表明,通过鼻黏膜免疫的疫苗可诱导机体生成免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA),有望成为疫苗的有效作用途径之一。但单独使用疫苗鼻黏膜免疫后不会在鼻腔中诱导强IgA产生,需要添加免疫佐剂激活先天免疫应答,增强抗原特异性IgA产生和细胞应答。目前应用的鼻黏膜免疫佐剂种类繁多,但佐剂促进免疫应答的具体机制仍不清楚。本文讨论了鼻黏膜免疫佐剂在鼻相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)中促进免疫应答的途径,为进一步对鼻黏膜免疫佐剂的相关研究提供参考。

体外小鼠nuocyte细胞中IL-13的干预促进CD4^+T细胞向CD4^+IL10^+细胞的分化

目的探讨体外小鼠nuocyte细胞中IL-13的干预对CD4^+ IL10 +细胞的分化的影响。方法用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)建立小鼠变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)模型( n =6),正常组注射生理盐水( n =6)。计数AR小鼠的打喷嚏、挠鼻次数,分离、提纯并体外培养小鼠鼻相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)中的nuocyte细胞;构建针对小鼠IL-13的shRNA,并用慢病毒将IL-13 shRNA转染体外培养的AR小鼠nuocyte细胞,分别检测转染前后培养基中nuocyte细胞在鼠重组(recombinant,rm)IL-33作用下分泌IL-13和IL-10的浓度;获取AR小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)并分离出CD4^+ T细胞进行体外培养,然后将体外培养的nuocyte细胞加入上述小鼠CD4^+ T细胞培养基共培养,检测CD4^+ IL10 +细胞所占CD4^+ T细胞的百分比。结果小鼠AR模型打喷嚏和挠鼻次数较正常小鼠显著增多,OVA诱导NALT来源的小鼠nuocyte细胞被鉴定为CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1(lineage)- ICOS +,AR小鼠的nuocyte细胞数较正常小鼠显著增多,携带有IL-13 shRNA的慢病毒成功转染到体外培养的nuocyte细胞。转染前经rmIL-33的刺激,培养基中IL-13和IL-10的浓度均升高,差异具有统计学意义;转染后培养基中IL-13的含量无明显增多,而IL-10含量明显增多,转染前后IL-13和IL-10的浓度差异具有统计学意义,IL-13浓度降低,IL-10浓度升高,而且转染后CD4^+ IL10 +细胞占CD4^+ T细胞的百分比也增加,差异具有统计学意义。结论体外小鼠nuocyte细胞中IL-13的干预可能促进CD4^+ IL10 +细胞的分化。

Nuocyte细胞对小鼠变应性鼻炎建模的作用研究

目的探讨nuocyte细胞对小鼠变应性鼻炎(AR)建模的作用。方法用卵清蛋白建立AR野生型小鼠模型,检测AR相关指标,分离、提纯并体外培养野生型小鼠鼻相关淋巴组织中的nuocyte细胞,体外检测该细胞对小鼠重组(recombinant,rm)白细胞介素33(interleukin-33,IL-33)干预后的反应;用卵清蛋白对IL-13基因敲除(IL-13-/-)小鼠进行AR建模,检测AR相关指标,随后将体外培养的nuocyte细胞对IL-13-/-小鼠进行过继转移,同时建模,再次检测AR相关指标,评估AR建模情况。结果野生型小鼠AR模型无论是喷嚏、挠鼻、鼻腔冲洗液中嗜酸性粒细胞数,还是IL-5和IL-13的浓度都显著增多,体外培养的nuocyte细胞经rmIL-33刺激后产生IL-5和IL-13;IL-13-/-小鼠AR模型在建模前后上述指标无明显差异,nuocyte细胞过继转移同时建模后,上述指标出现有统计学意义的差异,过继转移后的各项参数都显著高于常规建模。结论nuocyte细胞促进小鼠AR模型的变应性炎症反应。

霍乱毒素联合弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的GALT和NALT黏膜免疫应答

目的观察霍乱毒素（CT）联合弓形虫排泄-分泌抗原（ESA）鼻内免疫小鼠诱导的肠相关淋巴组织（GALT）和鼻相关淋巴组织（NALT）黏膜部位的免疫应答。方法将48只5～6周龄BABL／c小鼠随机均分为3组，分别用PBS、ESA和CT＋ESA滴鼻免疫小鼠2次，间隔2周。末次免疫后14d，处死小鼠，ELISA测定小鼠粪便和鼻咽冲洗液sIgA抗体水平；计数派伊尔淋巴集结（PP）、肠上皮淋巴细胞（IEL）、NALT和鼻通道（NC）淋巴细胞数，免疫细胞化学法检测CD4^＋、CD8^＋T细胞亚群水平。结果免疫后14d，CT＋ESA组小鼠鼻咽冲洗液和粪便sIgA水平显著高于ESA组和PBS组（P〈0．01）；CT＋ESA和ESA组小鼠GALT部位的PP淋巴细胞显著增生，主要以CD4^＋T细胞为主；而IEL以CD8^＋T细胞增生为主，CD4^＋／CD8^＋比值降低（P〈0．05）。CT＋ESA NALT内淋巴细胞明显增生。CT＋ESA组NC淋巴细胞显著升高（P〈0．01），以CD4^＋T细胞增生为主。结论CT佐剂联合ESA滴鼻免疫BALB／c小鼠可诱导GALT和NALT黏膜部位免疫应答。

rmIL-33诱导的nuocyte细胞促进变应性鼻炎小鼠模型的炎症反应

目的:探讨nuocyte细胞对变应性鼻炎(AR)小鼠模型的作用。方法:将人重组(rm)白细胞介素(IL)-33滴入BALB/c小鼠鼻腔,分离、提纯并体外培养小鼠鼻相关淋巴组织(NALT)中的nuocyte细胞,体外检测该细胞对rmIL-33干预后的反应;用卵清蛋白建立AR小鼠模型,将体外培养的NALT来源的nuocyte细胞过继转移给AR小鼠,检测其变应性炎症反应。结果:rmIL-33干预后小鼠NALT中nuocyte细胞数目明显多于AR组小鼠(t=3.66,P<0.01);体外培养的nuocyte细胞经rmIL-33干预后释放IL-13的浓度显著高于未干预组(t=19.90,P<0.000 1);nuocyte细胞过继转移后,其打喷嚏次数(t=9.89,P<0.000 1)、鼻腔冲洗液中嗜酸粒细胞数目(t=8.17,P<0.000 1)以及IL-13(t=40.47,P<0.000 1)和IL-33的浓度(t=19.89,P<0.000 1)均高于AR小鼠。结论:nuocyte细胞促进了小鼠AR模型的炎症反应。

nuocyte细胞体外诱导变应性鼻炎小鼠初始T细胞向Th2细胞的分化

目的:探讨nuocyte细胞是否可以在体外诱导AR小鼠的初始T细胞向Th2细胞分化。方法:用卵清蛋白建立变应性鼻炎(AR)小鼠模型,分离、提纯并体外培养小鼠鼻相关淋巴组织(NALT)中的nuocyte细胞,检测该细胞是否可以合成IL-4,获取AR小鼠外周血单个核细胞并分离出Th2细胞和T细胞进行体外培养,检测其中Th2细胞占T细胞百分比,然后将体外培养的NALT来源的nuocyte细胞加入上述小鼠T细胞培养液共培养,再次检测Th2细胞百分比。结果:AR小鼠模型的打喷嚏次数、挠鼻次数及鼻腔冲洗液中嗜酸粒细胞数均高于正常小鼠,以流式细胞仪技术将NLAT中nuocyte细胞鉴定为CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1(lineage)-ICOS+,该细胞表达IL-4,而且AR小鼠nuocyte细胞中IL-4蛋白和mRNA含量均高于正常小鼠,nuocyte细胞与T细胞共培养后,Th2细胞所占T细胞百分比明显升高。结论:nuocyte细胞可能通过IL-4通路在体外诱导AR小鼠初始T细胞向Th2细胞分化。