少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492对线虫的降解作用研究

【目的】为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492的生物学功能。【方法】对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能。【结果】几丁质酶AO-492有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18家族结构域,并含有糖苷水解酶18家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构。系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近。SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492分子量约为59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应。ReAO-Z492最适温度为40℃,最适pH为7.0;Mg^(2+)对其酶活有促进作用,而Ag^(+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)和Zn^(2+)有抑制作用。ReAO-Z492对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性。【结论】少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492 对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用。

不同环境和营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌生长、产孢及几丁质酶表达的影响

[目的]研究温度、pH和不同营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)生长及产孢特性的影响,分析其在碳氮饥饿条件下几丁质酶的表达水平,优化该菌的培养条件,为该菌的扩大培养提供参考依据。[方法]将圆锥节丛孢菌AC-shz1菌株接种于YPSSA培养基,分别置于不同温度(15、20、25、30和35℃)、pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、碳源(果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、几丁质)、氮源(甘氨酸、苯丙氨酸、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素)和碳氮比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)环境条件下进行培养,观察并记录菌丝的生长速度及形态,测定其产孢能力;在碳氮源饥饿条件下,采用实时荧光定量PCR方法对4种几丁质酶基因的表达水平进行分析。[结果]圆锥节丛孢菌在温度15~30℃均能生长,其中以25℃时菌丝生长最快且产孢能力最强;在pH为6.5~7.5时菌丝生长良好,其中以pH 7.0时产孢能力最强。圆锥节丛孢菌最适菌丝生长和产孢碳源为葡萄糖和蔗糖,其中含葡萄糖的培养基产孢量最高;最适氮源为酵母粉和蛋白胨,含酵母粉的培养基产孢量最高,以葡萄糖和酵母粉为碳氮源的最适碳氮比为5∶1。与对照组相比,在碳饥饿条件下,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-14(AC-14,P<0.01)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-190(AC-190,P>0.05)基因转录水平上调,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-379(AC-379,P>0.05)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-483(AC-483,P<0.01)基因转录水平下调;在氮饥饿条件下,上述4种几丁质酶基因转录水平均极显著下调(P<0.01)。[结论]菌丝生长和产孢最适温度为25℃,最适pH为7.0,最适碳氮源分别为葡萄糖和酵母粉,最适碳氮比为5∶1。本研究结果为进一步研发具有高效的捕食线虫真菌生物防控制剂奠定了基础。

温度和pH对捕食性线虫分离株-长孢隔指孢菌生长的影响及生物学特性的观察

为了观察捕食线虫性真菌长孢隔指孢菌（Dactylella leptospora）的生物学特性及pH和温度对该菌生长的影响。将分离株长孢隔指孢菌接种于0.6g/L玉米粉琼脂培养基（CMA）中,分别置15℃、20℃、25℃、30℃恒温箱中培养,又将该菌分别接种到pH为4、5、6、7、8、9、10、11、12的0.6g/L CMA,定时观察菌株的发育情况,测量菌丝生长长度。结果表明：长孢隔指孢菌在pH为4~12的环境下均能生长,其中以pH为11.0时生长速度最快;在温度为15~30℃时均能生长,当培养温度为25℃时生长最佳。此外,对该分离株生物学特性进行研究,该菌的特征为分生孢子梗直立、无色、分隔,分生孢子无色,长纺锤形,5~9个分隔,捕食器官为粘球和非收缩环。

三江并流区澜沧江干流捕食线虫真菌的水陆分布模式探究

为研究三江并流区澜沧江干流水、陆生境中的捕食线虫真菌(Nematode-TrappingFungi,NTF)多样性分布差异,在该区域布设9个采样区对NTF进行调查,并分析NTF在澜沧江流域不同空间尺度下的水陆分布模式。每个样区设置水、陆对称采样点各5个,每个采样点用5点法采集水、陆样品各1份,共采集90份样品。采用单孢子挑离法获得NTF纯培养,结合形态学和分子生物学方法鉴定物种。共获得2属13种76株NTF,其中陆生土壤中检出2属11种49株,水体底泥中检出1属6种27株。结果显示,NTF物种组成在三江并流区澜沧江干流水、陆生境间存在较大差异,具有水陆异质性分布模式,干流陆地上具有比水生环境中更高的物种检出率和物种多样性;此外,与之前对澜沧江支流NTF的水陆分布研究结果相比,NTF在干流上水陆分布差异比支流更大,表明在流域生态系统中,NTF的监测结果同时也能反映不同空间尺度下的环境异质性,以流域为研究单元,以NTF为研究对象,可能更有助于了解微生物的空间分布格局。

捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌体外杀寄生性线虫幼虫的研究

对捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)菌株体外粪便捕杀马寄生性线虫幼虫进行了研究。结果表明:菌株可以在体外粪便中发育并发挥其捕食作用。在实验室条件下,其对寄生性线虫第一、二期幼虫的作用与对第三期幼虫的作用相比较,捕获致死速度快。菌株对马粪便中线虫幼虫的杀虫率高达98.7%;与对照组相比有显著差异。而且加入粪便的分生孢子数量在达到一定阈值后,再加入分生孢子,则杀虫率不再增加。此结论对捕食线虫性真菌今后临床的应用具有实际指导意义。

口服少孢节丛孢菌孢子对家畜粪便中线虫幼虫的杀灭研究

对捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)菌株进行了临床杀家畜寄生性线虫幼虫作用的研究。结果表明:培养的少孢节丛孢菌分生孢子经口饲喂动物后,对粪便中线虫幼虫的杀虫率分别可达96.3%(羊)、96.5%(牛)和97.4%(马)。说明少孢节丛孢菌菌株分生孢子可通过家畜消化道,并保持了其捕食寄生性线虫的能力。研究结果为捕食线虫性真菌的临床应用奠定了重要基础。

捕食线虫性真菌的分离培养及分布规律

对自然界中的捕食线虫性真菌进行了分离和种属区分 ,并对分布规律进行了研究。从土壤、粪便等材料中获得了2类活性较强的捕食线虫性菌株 :即套捕型 (hooping)捕食线虫性真菌和粘捕型 (sticking)捕食线虫性真菌。主要的代表种类有 3种。这些捕食线虫性真菌在捕食性结构分生孢子形态及某些生物学特性上有一定差异。套捕型捕食线虫性真菌代表种为少孢节丛孢菌 (Arthrobotrys oligospora)和梨形指环菌 (Dactylaria pyriformis) ,它们以菌环、菌网作为捕食性结构 (器官 ) ,以套捕方式杀灭线虫幼虫。梨形指环菌可产生多量厚垣孢子 (chlamydospore)。粘捕型捕食线虫性真菌代表种为纺锤隔指孢菌 (Dactylella ellipsospora)。可形成菌结捕食线虫性结构 ,以粘捕的方式杀灭线虫幼虫。结果表明 :捕食线虫性真菌在土壤和家畜粪便中的分离率是 4 0 .4 1% ;此类菌适合于生存在阴暗、潮湿、富含腐植质的环境中。在温暖季节时 ,采用 0 .4 g/ L玉米粉琼脂培养基 (CMA)

捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌理化特性研究

研究了捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌 (Arthrobotrysoligospora)的染色特性、分生孢子对外界理化因素的抵抗力以及菌丝对线虫第三期幼虫的吸引作用等。结果表明少孢节丛孢菌用革兰氏、瑞氏、姬姆萨氏液染色都能很好的着色 ;分生孢子对高温敏感 ,对抗生素不敏感 ,高浓度的氢离子或氢氧根离子能杀死分生孢子 :但分生孢子耐低温 ,因此可用低温冷冻法保存捕食线虫性真菌分生孢子 ,其方法简便易行。首次解决了国内外在捕食线虫性真菌菌种保存中的难题。研究显示菌丝对线虫第三期幼虫无明显吸引力。

2种捕食线虫性真菌生长特性和捕食效力比较

对少孢节丛孢菌 (Arthrobotrys oligospora Strain:A1)和纺锤隔指孢菌 (Dactylella ellipsospora Strain:Da1)的生长特性和捕食效力进行了比较。结果表明 :少孢节丛孢菌菌株与纺锤隔指孢菌菌株的最佳生长温度不同 ,前者为2 0℃ ,后者为 2 5℃ ;少孢节丛孢菌菌株对无氧条件有一定的耐受性 ,而纺锤隔指孢菌菌株在无氧条件下不能很好生长 ;少孢节丛孢菌菌株与纺锤隔指孢菌菌株分别在其最佳生长温度 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,对马自然混合感染的线虫第 3期幼虫平均捕食率达 78.2 %和 80 .1% ,二者相比 。

捕食线虫性真菌18S rDNA基因序列与种系发生关系研究

对捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌A1分离株(ArthrobotrysoligosporaA1)的18SrDNA基因序列进行了研究。结果表明:其18SrDNA全基因序列为1769bp,在进化树上与同种国外分离株A.oligosporavaroligospora1最为接近,同源性为94.7%,这与二者都具有捕食性结构—菌网的特点相一致,证实捕食线虫性真菌的捕食性结构与捕食线虫性真菌种系发生有关。从少孢节丛孢菌3个分离菌株(ArthrobotrysoligosporaA1、A.oligospora1、A.oligospora2)的进化树及同源性来看,不同国家地区的丛孢菌属(Arthrobotrys)分离株确实存在差异。

捕食线虫性真菌生长特性的研究

对捕食线虫性真菌菌丝、分生孢子、厚垣孢子、捕食性结构的发育过程和特点及其在 0 .4g/L玉米粉琼脂固体培养基和液体培养基中的生长情况进行了研究。结果表明 ,捕食线虫性真菌菌丝在 0 .4 g/L玉米粉琼脂固体培养基上呈树枝形放射状生长 ,有的菌株还可以在 0 .4g/L 玉米粉液体培养基中呈絮状生长 ;分生孢子位于垂直的分生孢子梗顶端或近顶端部 ,多数出现在菌丝的生长后期 ;厚垣孢子在菌丝上呈插入性生长 ,在老的培养基中容易发现 ,且与捕食线虫性真菌的种类有关 ;捕食性结构在受到活线虫幼虫的刺激之后才会产生 ,而线虫虫卵与成虫并不能导致捕食性结构的产生。

北京地区苹果及葡萄根际捕食线虫真菌的种类及分布

对北京郊区果园的苹果和葡萄根际的捕食线虫真菌进行调查，发现苹果和葡萄的根际不同位置的捕食线虫真菌数量不同，内根际（包括根表）捕食线虫真菌数量大于外根际，而外根际捕食线虫真菌数量又大于游离土壤中的捕食线虫真菌数量；在苹果根际发现的捕食线虫真菌共有９种：Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ，Ａ．ｃｌｉｇｏｓｐｏｒａ，Ａ．ｍｕｓｉｆｏｒｍｉｓ，Ａ．ｃｌａｄｏｄｅｓ，Ａ．ｂｒｏｃｈｏｐａｇａ，Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｓｐ．，Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍｅｕｄｅｒｍａｔｕｍ，Ｍ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓｅｓ，Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍｓｐ．，其中以Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ出现的频率最高。在葡萄根际发现的捕食线虫真菌共７种：Ａ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ，Ａ，ｃｌａｄｏｄｅｓ，Ａ．ｃｏｎｏｉｄｅｓ，Ａ．ｓｕｐｅｂａ，Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｓｐ，，Ｍ．ｓａｌｉｎｕｍ，Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍｓｐ．，其中以Ａ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ出现的频率最高。

捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌口服生物制剂安全性试验

为研究少孢节丛孢菌口服生物制剂的安全性,将20只6月龄绵羊分成4组,前3组分别灌服含有1.0×105、1.0×106、1.0×107少孢节丛孢菌分生孢子口服生物制剂,第4组为对照组灌服灭菌的生理盐水,灌服后连续30d观察绵羊的各项临床指标;并在7d后每组分别剖检2只绵羊,无菌采集绵羊各器官组织,进行组织切片和少孢节丛孢菌的分离鉴定;另外,将12只感染捻转血矛线虫后的绵羊分成3组,灌服3个不同剂量的生物制剂后测定其对粪便中线虫的捕食活性。结果表明,绵羊的精神状态、食欲、饮水、体温、粪便、增量正常;绵羊肝脏、脾脏、肾脏、肠道淋巴结等组织器官没有出现病理变化;也未从上述组织中分离出少孢节丛孢菌;3个不同剂量的生物制剂均可显著降低绵羊粪便中的幼虫数量。研究结果证实,少孢节丛孢菌口服生物制剂安全有效,无毒副作用。

少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物在捕食线虫过程中的作用研究

为了解捕食性真菌——少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物的性质及在捕食线虫过程中的作用,作者首先用氨基酸诱导产生大量捕食器(菌环和菌网)菌丝,然后分别应用5种不同化学性质的溶液、2种酶和7种蛋白酶抑制剂处理捕食器表面聚合物,观察对捕食和致死线虫作用的影响,同时使用上述物质或溶液处理菌丝以确定对菌丝生长的影响。结果表明:5 mol.L-1LiCl溶液和链霉蛋白酶E可明显降低真菌的捕获线虫的能力;0.1 mol.L-1NaOH、SDS-巯基乙醇-尿素PBS溶液、1.5%(w/v)SDS除可抑制捕获虫体外,同时还抑制了真菌菌丝的生长;除菲啰啉外,其余6种酶抑制剂对真菌的黏附捕获作用无明显影响;但其中丝氨酸蛋白酶类抑制剂还可抑制真菌对线虫的致死作用;另外用酶抑制剂处理线虫后,对真菌的黏附捕获作用也无明显影响。上述结果表明少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物在黏附捕获线虫过程中起关键作用,其为蛋白质或含蛋白质类物质;并间接证实黏附捕获阶段不需要蛋白酶参与,但其在致死线虫阶段会发挥重要作用。这为阐明捕食性真菌作用机理提供了非常有价值的资料。

少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因同源性分析

为了比较不同地理株的捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因的同源性,首先利用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒,提取少孢节丛孢菌内蒙古株(Arthrobotrys oligospora CHIM)的DNA,然后根据GenBank中相应丝氨酸蛋白酶基因,分别设计上下游引物;再经PCR扩增后,纯化并回收扩增产物,然后进行序列测定并分析。结果表明:少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶基因序列与少孢节丛孢菌瑞典株(AY444597)和少孢节丛孢菌云南株(AF516146)同源性分别为80.3%和84.1%;虽然这3株菌具有较高的亲缘性,但其差异也非常明显,这一结果说明少孢节丛孢菌在不同国家或地区间有差异。

松材线虫捕食真菌——少孢节丛孢HNQ11菌株初步研究

从海南岛香蕉根围土壤分离得到松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus,PWN)捕食真菌HNQ11菌株,鉴定为少孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)。研究了HNQ11菌株的捕食作用及影响HNQ11捕食率的因素,结果表明,HNQ11菌株对松线虫表现出较好的捕食作用。HNQ11在含20g/L玉米粉的CMA培养基上捕食率最高;20￣28℃,pH6.5￣7.5条件下均能捕食松材线虫,25℃,pH6.5条件下捕食率最高,为87%;在不加入诱饵松材线虫或仅加入线虫洗液时不能产生捕食器官,在加入诱饵松材线虫和线虫磨碎液时能产生捕食器官,但线虫磨碎液诱导的菌环数比PWN诱导的菌环数少78%。

食线虫真菌防治植物寄生线虫研究进展

植物寄生线虫作为一类植物病原,对全球农林业产生严重危害,每年由植物寄生线虫造成的损失平均高达1570亿美元。食线虫真菌作为一种安全、高效、低毒防治线虫的生物技术,已受到广泛关注。讨论了食线虫真菌的分类、对线虫的作用机制、防控效果的影响因素和应用现状,并在此基础上,对食线虫真菌与植物寄生线虫互作的研究前景进行了展望。

立枯丝核菌重寄生真菌的筛选

从捕食线虫的真菌中筛选到立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)的 8种重寄生真菌 ,即粉红粘帚霉(Gliocladium roseum) ,少孢节丛孢 (Arthrobotrys oligospora) ,弯孢节丛孢 (A.musiformis) ,贵州节丛孢 (A.guizhouense) ,圆锥节丛孢 (A.conoides) ,指状节丛孢 (A.dactyloides) ,多孢节丛孢 (A.superba) ,蠕虫状节丛孢 (A. vermicola)。平板测试表明这 8种重寄生菌能不同程度地影响立枯丝核菌的生长 ,减少菌核的形成数量。其中粉红粘帚霉的寄生力最强 ,可使菌核数减少 5 8.6 7% ,交叉菌落内几乎所有的立枯丝核菌菌丝被寄生。营养条件对重寄生有明显的影响 ,在低营养培养基 CMA和WA上寄生程度严重 ,在营养相对较高的 PDA和 CSA上寄生程度较轻。太高的 C∶N(30 0∶ 1)和太低的 C∶ N(1∶ 1,10∶ 1)都不利于重寄生 ,只有适当的 C∶ N(5 0∶ 1,10 0∶ 1)

捕食线虫性真菌菌种保存技术的研究

本试验对捕食线虫性真菌菌种保存技术进行了研究,测定了在不同介质保存条件下,捕食线虫真菌分生孢子和菌丝的存活情况及其不是寄生性线虫的能力。结果表明:在设定的保存条件下,分别经过1周冷冻融化或2周反复冷冻融化,被保存的分生孢子接种于玉米粉琼脂培养基上能生长发育:在加入线虫第3期幼虫后,能生产捕食器,对虫体发挥捕食作用。

漾濞核桃根际捕食线虫真菌多样性研究

2009～2010年从采自漾濞彝族自治县的500份核桃根际土壤样品中分离到3个属18种捕食线虫真菌,其中检出频率较高的是Arthrobotrys musiformis和Monacrosporium thaumasium,检出率分别为16.97%和12.96%。通过对四个季节捕食线虫真菌多样性分析,发现夏季和秋季的物种多样性指数较高,分别为2.38和2.35;其次是春季,为2.00;冬季的相对较低,为1.76。在所有检测到的捕食线虫真菌中,产黏性网的捕食线虫真菌占77.78%。