Wnt/β-catenin通路在新北美圣草苷促进BMSCs成骨分化中的介导作用

目的:探究新北美圣草苷激活Wnt/β-catenin通路促进骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成骨分化的具体机制,为其应用于临床治疗提供理论基础。方法:选取SPF级3月龄大鼠30只,随机分为对照组、低剂量组、高剂量组,每组10只,分别给予生理盐水、0.81g/kg及4.05g/kg骨碎补水煎液灌胃并制备含药血清。培养并鉴定BMSCs。以不同浓度含药血清干预BMSCs并比较各组的细胞增殖能力,矿化能力,β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2、GSK-3βmRNA表达水平及β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平。结果:与对照组相比,给药两组各时间点的细胞增殖能力更强,且高剂量组优于低剂量组;与对照组相比,给药两组的矿化结节数量明显升高,且高剂量组矿化结节数量多于低剂量组;给药两组的GSK-3βmRNA表达明显低于对照组,且高剂量组低于低剂量组,β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA表达明显高于对照组,且高剂量组高于低剂量组;同时给药两组的β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平明显高于对照组,且高剂量组高于低剂量组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:新北美圣草苷可能通过激活Wnt/β-catenin通路,上调β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA表达并下调GSK-3βmRNA表达,同时上调β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平,进而促进BMSCs增殖和成骨分化。

HPLC同时测定骨碎补药材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量

目的:建立同时测定骨碎补类药材中新北美圣草苷和柚皮苷含量的反相高效液相色谱法。方法:采用 Hypersil ODS2色谱柱(5μm,250mm×4.6mm),以乙腈-0.4%醋酸水溶液(20:80)为流动相,流速为1.0mL·min^(-1),柱温为室温,检测波长为283nm。结果:样品中新北美圣草苷和柚皮苷平均回收率分别为100.1%和99.4%;新北美圣草苷和柚皮苷的线性范围分别为12～480μg·mL^(-1)(r=0.9997)和10～400μg·mL^(-1)(r=0.9999)。结论:该方法可用于骨碎补药材的质量控制,方法简便,准确,重现性好。

基于主成分分析的骨碎补药材乙醇和环己烷提取物的高效液相色谱指纹图谱及指标成分的定量分析

建立了骨碎补药材乙醇和环己烷提取物的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,并利用主成分分析法(PCA)对指纹图谱进行统计分析,以各主要色谱峰的保留时间和峰面积为变量得到score图和loading图。在score图和loading图中,骨碎补的正品和非正品可明显区分,且揭示出对此区分贡献最大的4个潜在指标成分,其中已知成分为柚皮苷、新北美圣草苷和E-4-O-β-D-葡萄糖酰咖啡酸。同时测定了这3种成分在19批正品和非正品骨碎补药材中的含量,其中10批骨碎补药材正品中3种成分的含量为:柚皮苷6.36～10.1mg/g,新北美圣草苷5.14～9.21mg/g,E-4-O-β-D-葡萄糖酰咖啡酸1.87～3.19mg/g。该方法更全面地反映了药材的化学成分信息,并能从定性和定量两方面控制骨碎补药材的内在质量。

从化州柚中提取的柚皮苷的杂质研究(英文)

目的:研究从化州柚中提取的柚皮苷中的杂质。方法:采用HPLC-PDA/ESI-MS/MS法,通过波谱分析鉴定化合物结构。采用加校正因子的主成分自身对照法对主要杂质进行含量测定。结果:柚皮苷样品中主要杂质为野漆树苷和新北美圣草苷,二者与柚皮苷的校正因子分别为1.82和1.02。对6批样品进行测定,野漆树苷的含量为0.742%～0.926%,新北美圣草苷的含量为0.335%～0.464%,总杂质含量小于1.5%。结论:该检测方法快速、准确,柚皮苷中杂质种类和含量稳定,为柚皮苷应用的安全性提供理论基础。

Protective Effects of Many <i>Citrus</i>Flavonoids on Cartilage Degradation Process

The objective of this study was to investigate the effects of many citrus flavanones, such as neoeriocitrin, naringin and neohesperidin, in cartilage degradation. Degenerative joint disease involved degradation of joints, including articular cartilage and subchondral bone. When bone surfaces become less well protected by cartilage, bone may be exposed and damaged. The degradation cartilage is mediated by alteration of the balance between anabolic and catabolic processes, changes in proteolytic enzyme activity, mechanical disruption of the cartilage extracellular matrix (ECM), or a combination of these processes. We examine the capability of neoeriocitrin, naringin and neohesperidin, to inhibit metalloproteinase (MMP)-13, collagenase involved in degradation of cartilage matrix components. Also, we assay the flavonoids effect on reducing of Glycosaminoglycans (GAGs) release, and restore Nitric oxide (NO) levels in explant of human articular cartilage. Our results suggest that neoeriocitrin, naringin and neohesperidin are a potential therapeutic agent to protect cartilage tissue.

注射用骨碎补总黄酮的处方工艺及其含量测定方法研究

目的制备注射用骨碎补总黄酮并建立其含量测定方法。方法筛选赋形剂的种类和用量,得出最佳处方和制备工艺;以HPLC法测定其含量。结果使用100 g·L-1甘露醇作为赋形剂效果最好;含量测定新北美圣草苷和柚皮苷的平均回收率分别为99.6%和99.3%。结论处方合理,制备工艺可行。含量测定方法准确、方便、重现性好。

RP-HPLC法测定骨疏丹颗粒中5种有效成分的含量

目的采用RP-HPLC法同时测定骨疏丹颗粒剂中新北美圣草苷、柚皮苷、淫羊藿苷、欧前胡素、蛇床子素5种活性成分。方法采用Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，柱温为室温，检测波长285 nm。结果各个成分的峰面积与其质量浓度的线性关系良好（r〉0.999 0），加样回收率为95.8 %-98.6 %。结论该方法简单、准确、重现性好，可为全面评价复方骨疏丹颗粒剂的质量提供依据。

砂烫骨碎补炮制工艺的研究

目的优选砂烫骨碎补的炮制工艺,确定其工艺参数。方法以形态、色泽、去毛情况、柚皮苷和新北美圣草苷的含量为考察指标,选取加热温度、加热时间、砂用量3个因素,应用L9(34)正交设计表,采用方差分析优选骨碎补砂烫工艺。结果最佳炮制工艺参数为用40倍量砂,190℃砂烫4min。结论优选的炮制工艺稳定可行,为砂烫骨碎补提供了试验依据。

从骨碎补中制备新北美圣草苷和柚皮苷对照品的研究

目的建立从骨碎补中制备新北美圣草苷和柚皮苷对照品的方法。方法结合大孔树脂富集、硅胶柱色谱、中性氯化铝吸附、Sephadex LH-20柱色谱和重结晶方法对骨碎补乙醇提取物进行分离纯化,通过MS、IR、UV、~1H-NMR和^(13)C-NMR进行结构鉴定。结果制备得到的新北美圣草苷和柚皮苷质量分数分别为99.5%、99.3%。结论建立的制备方法简单,对照品质量分数高,可作为骨碎补药效物质基础研究和骨碎补药材质量控制的对照品。

HPLC法同时测定骨碎补中两种黄酮类化合物含量

目的:研究骨碎补提取物中柚皮苷(Naringin,Nar)和新北美圣草苷(Neoeriocitrin,Neo)含量同时测定的方法。方法:采用CQ5-4069 ODs色谱柱,HPLC-DAD测定骨碎补提取物中两种黄酮类成分柚皮苷和新北美圣草苷含量。结果:骨碎补55%乙醇提取部位柚皮苷含量为32.19%,新北美圣草苷含量为17.66%。结论:高效液相色谱法(HPLC)可以同时测定骨碎补提取物中柚皮苷和新北美圣草苷的含量,可用于骨碎补提取物的质量控制。

HPLC梯度洗脱法同时测定壮血药酒中4种成分的含量

目的建立同时测定壮血药酒中新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯4个主要成分含量的高效液相色谱检测方法。方法采用依利特C18柱;流动相A为乙腈-甲醇（1∶2）,流动相B为0.4%冰醋酸溶液,梯度洗脱;流速为1.1 mL/min;柱温为25℃;检测波长λ_1=283 nm（新北美圣草苷和柚皮苷）,λ2=222 nm（补骨脂素和佛手柑内酯）。结果在优化的色谱条件下,新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的线性范围分别为6.52~130.40μg/mL（r=0.999 7）、6.61~132.20μg/mL（r=0.999 3）、6.75~135.00μg/mL（r=0.999 6）、4.05~81.00μg/mL（r=0.999 9）;4种成分的平均加样回收率（n=6）分别为96.94%、99.14%、98.09%、96.87%,RSD分别为0.75%、0.52%、1.18%、1.02%。结论该方法简便快捷,回收率、重复性良好,可用于壮血药酒中新北美圣草苷、柚皮苷、补骨脂素和佛手柑内酯的含量分析。

HPLC法同时测定升血调元汤中4种成分的含量

目的建立高效液相色谱法同时测定升血调元汤中新北美圣草苷、二苯乙烯苷、特女贞苷和柚皮苷的含量。方法采用Hypersil ODS C_(18)色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长为224 nm,柱温为25℃。结果新北美圣草苷、二苯乙烯苷、特女贞苷和柚皮苷分别在6.874~220.0μg·mL^(-1)、1.619~51.82μg·mL^(-1)、1.842~58.95μg·mL^(-1)和7.958~254.7μg·mL^(-1)线性关系良好,r均≥0.9999;平均加样回收率分别为:96.37%(RSD=0.70%,n=6),99.15%(RSD=0.81%,n=6),97.28%(RSD=0.37%,n=6),97.46%(RSD=0.22%,n=6)。结论该方法简便、专属性强,重复性好,结果准确,可用于升血调元汤的质量控制。

HPLC法测定枳壳中6个二氢黄酮类成分的含量

目的:建立HPLC法测定枳壳药材中6个黄酮类成分圣草次苷、新圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量。方法:采用Inertsil ODS-4(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-0.1%磷酸(18∶82),流速1.0 mL.min-1,检测波长283 nm,柱温30℃。结果:圣草次苷、新圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷6个二氢黄酮类化合物的质量分别在0.02～0.16、0.60～0.54、0.02～0.18、0.41～3.70、0.16～1.40、0.22～1.99μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,r分别为0.9995、0.9999、0.9999、0.9999、0.9999和0.9999;平均加样回收率(n=6)分别为100.8%、102.5%、97.8%、99.6%、98.0%、102.7%。结论:含量测定方法可作为中药枳壳的质量控制的有效方法。

三七伤药片超高效液相色谱特征图谱的研究

目的：建立三七伤药片的UPLC特征图谱,为三七伤药片的质量评价提供参考。方法：采用UPLC法建立特征图谱,通过液质联用对特征峰进行指认。采用ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm,1.7μm）色谱柱,以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0~10 min,4%A→12%A;10~22 min,12%A→16%A;22~35 min,16%A→25%A）,流速0.2 mL·min-1,检测波长230 nm,柱温40℃;并采用电喷雾离子源进行正/负离子模式同时扫描,对特征峰进行指认。采用ChempatternTM软件将三七伤药片的特征图谱生成共有模式,并进行PCA统计分析,以各主要色谱峰的保留时间和峰面积为变量得到Score图和Loading图。结果：以柚皮苷峰为参照物峰建立三七伤药片UPLC特征图谱,确定了8个共有特征峰,并指认了新北美圣草苷、芍药苷、羟基红花黄色素A和柚皮苷4个特征峰。采用主成分分析（PCA）对特征图谱数据进行分析,结果表明不同样品化学成分存在差异,其中柚皮苷、新北美圣草苷和芍药苷的差异较大。结论：建立的UPLC特征图谱方法具有较好的稳定性和重现性,能为三七伤药片的质量控制提供参考。

RRLC-MS/MS法同时测定骨刺片中14个成分的含量

目的:建立RRLC-MS/MS法同时测定10个厂家生产的骨刺片中14个成分的含量。方法:采用Agilent ZORBAX SB-C_(18)色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱,流速为0.3 mL·min^(-1),柱温30℃,进样量2μL;质谱采用负离子扫描,多反应监测(MRM)模式,脱溶剂温度350℃,脱溶剂气流(N_2)600 L·h^(-1),雾化器压力0.2 MPa,毛细管电压4.0 kV,皂苷类成分采用积雪草苷为内标,其他类成分采用水杨酸为内标。结果:新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、新北美圣草苷、柚皮苷、党参炔苷、三七皂苷R_1、人参皂苷Rg_1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb_1和人参皂苷Rd分别在0.008～8.208、0.004～4.084、0.009～9.312、0.008～8.368、0.005～5.416、0.004～4.344、0.001～3.928、0.002～8.512、0.004～1.864、0.008～4.104、0.009～4.560、0.008～4.120、0.010～4.932、0.008～2.188μg·mL^(-1)范围内线性关系良好,R2≥0.999 3,定量下限为0.8～9.9 ng·mL^(-1),加样回收率为95.7%～106.8%。采用建立的方法对骨刺片样品进行含量测定,结果显示,新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、隐绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、新北美圣草苷、柚皮苷、党参炔苷、三七皂苷R_1、人参皂苷Rg_1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb_1和人参皂苷Rd在骨刺片样品中的含量分别为10.73～663.41、235.40～995.78、62.16～1315.00、9.74～873.45、43.15～576.11、14.69～1337.46、0.52～194.73、0～428.61、0～9.969、0～240.51、0～1045.38、0～109.53、0～866.82、0～197.84μg·片^(-1),可以看出,除马钱苷酸外,其他成分在不同厂家生产的骨刺片中含量差异非常大,提示部分厂家在白芍、杜仲叶、骨碎补、三七及党参等药材的投料上可能存在问题。结论:本实验建立的多指标含量测定方法灵敏、准确,可用于全面评价骨刺片的质量优劣,对于提高骨刺片的质量标准、规范厂家的生产行为具有重要意义。

枳壳HPLC特征图谱及6个黄酮苷类成分含量测定

目的:采用高效液相色谱法建立枳壳的特征图谱,并同时测定6个黄酮苷类成分的含量。方法:以新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷为指标性成分,采用Kinetex?2.6μC18 100(100 mm×4.6 mm,2.6μm)色谱柱,以乙腈为流动相B,0.1%甲酸为流动相A,梯度洗脱(0~10 min,15%B→15%B;10~15 min,15%B→20%B;15~20 min,20%B→25%B;20~30 min,25%B→40%B),流速1.0 mL·min-1,检测波长为283 nm,柱温30℃。结果:建立枳壳特征图谱,30 min内枳壳的主要色谱峰能够达到完全分离,同时标定6个黄酮苷类成分,对12批饮片中的6个成分进行含量测定。新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷的质量浓度分别在1.77~70.8μg·mL-1(r=0.999 8,n=5)、11.3~452.0μg·mL-1(r=1.000 0,n=5)、34.0~1 360μg·mL-1(r=0.999 9,n=5)、13.6~544μg·mL-1(r=1.000,n=5)、27.6~1 104μg·mL-1(r=0.999 6,n=5)、 14.9~596μg·mL-1(r=1.000,n=5)范围内线性关系良好,方法的平均回收率(n=6)分别为96.9%(RSD=1.8%)、104.6%(RSD=1.7%)、97.4%(RSD=1.11%)、107.4%(RSD=1.1%)、93.2%(RSD=1.1%)、107.8%(RSD=1.5%);12批枳壳中上述6个成分含量分别为0.11%~0.45%、0.17%~0.59%、4.85%~9.09%、0.37%~0.74%、3.24%~6.17%、0.05%~0.56%。结论:该方法操作简单,重复性好,并能同时测定6个黄酮苷类成分含量,可为枳壳的质量标准研究提供更加全面的依据。

骨碎补化学成分及其对PC12细胞的保护作用研究

目的研究骨碎补(Drynaria fortunei)的化学成分及其对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用。方法采用溶剂法提取,利用硅胶、Sephadex LH-20及ODS柱色谱等方法分离纯化,根据质谱(MS),核磁共振法(NMR)等波谱技术鉴定化合物的结构;建立β淀粉样蛋白(Aβ)_(25-35)诱导PC12细胞损伤体外模型,分别加入不同浓度的化合物,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力。结果从骨碎补中分离并鉴定9个化合物:柚皮苷(1)、新北美圣草苷(2)、5,7-二羟基色原酮-7-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖基(3)、(E)-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基反式咖啡酸(4)、山柰酚(5)、木犀草素(6)、原儿茶酸(7)、补骨脂素(8)和β-谷甾醇(9)。对化合物1~8进行了细胞实验,结果表明,化合物1~8可促进Aβ_(25-35)诱导损伤的PC12细胞增殖,细胞活力随着浓度的增加而加强,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论化合物1~8对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤具有明显的保护作用,为中药骨碎补保护中枢神经功能的主要活性成分。

基于AHP-熵权法结合正交试验设计优选岭南特色饮片制枳壳的发酵工艺及发酵前后成分对比研究

目的 建立枳壳发酵品中多个成分的含量测定方法,优化岭南特色饮片制枳壳的发酵工艺,并比较枳壳发酵前后的成分变化。方法 通过UHPLC测定枳壳发酵品中特征成分含量,在单因素实验的基础上,采用正交试验法考察发酵温度、发酵时间、发酵湿度等影响因素,以枳壳发酵品中的10种特征黄酮类成分(包括黄酮苷及苷元)的含量和发酵品的外观性状作为指标,采用层次分析法(analytic hierarchy process,AHP)结合熵权法对这些指标设置不同的权重,并计算复合评分来优选其发酵工艺。结果 枳壳的最佳发酵工艺为浸泡时间4 h,发酵时间48 h,发酵温度37℃,发酵湿度90%;枳壳发酵后,黄酮苷类成分的含量下降,黄酮单糖苷和苷元类成分的含量均大幅度增加。结论 建立的UHPLC多成分含量测定方法操作简单、准确,优选的枳壳发酵工艺简便、稳定可行,可规范枳壳的发酵工艺,为制枳壳的工业化生产奠定基础。

新北美圣草苷对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

目的研究新北美圣草苷对淀粉样β蛋白片段25-35(Aβ_(25-35))诱导PC12细胞损伤的保护作用,探讨其防治AD的作用机制。方法采用MTT法检测新北美圣草苷对正常PC12细胞及Aβ_(25-35)损伤PC12细胞增殖的影响,筛选新北美圣草苷溶液的干预浓度。将PC12细胞按随机数字表法分为空白组、模型组、雌二醇组和新北美圣草苷组。空白组与模型组以DMEM培养24 h;雌二醇组加入DMEM和1×10^(-3)μmol/L雌二醇溶液;北美圣草苷组加入DMEM和6×10^(4)μmol/L新北美圣草苷溶液,培养2 h后,除空白组外,其余各组加入20μmol/L的Aβ_(25-35)储备液,继续培养22 h。采用AnnexinV-FITC/PI双标记检测凋亡率,Western blot法检测雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)及p-P38/P38蛋白表达,检测PC12细胞上清中乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)含量及胆碱乙酰转移酶(Choline acetyl transferase,ChAT)、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholin esterase,AChE)活性。结果与模型组比较,新北美圣草苷组细胞凋亡率[(8.080±0.578)%比(18.500±0.870)%]降低(P<0.01),ERβ蛋白[(0.348±0.042)比(0.273±0.006)]表达升高(P<0.01),p-P38/P38蛋白[(0.372±0.058)比(0.571±0.063)]表达降低(P<0.01),ACh[(14.319±1.039)μg/mg比(9.157±1.605)μg/mg]水平及ChAT[(0.715±0.053)U/mg比(0.280±0.093)U/mg]活性增高(P<0.01),AChE[(2.607±2.048)U/mg比(6.038±1.867)U/mg]活性降低(P<0.01)。结论新北美圣草苷可促进Aβ_(25-35)损伤的PC12细胞增殖,抑制细胞凋亡,具有一定的细胞保护作用,其作用机制可能与调节ERβ表达,抑制P38蛋白磷酸化,提高胆碱能系统功能有关。

UPLC-Q-TOF-MS联用研究不同厂家前列癃闭通片指纹图谱

目的通过建立前列癃闭通片(Qianlielong Bitong Tablets,QBT)的UPLC指纹图谱,考察了9个厂家58批次QBT的质量,为完善该制剂的质量控制奠定基础。方法采用UPLC法,色谱柱Eclipse Plus C18 RRHD(50 mm×2.1 mm,1.8μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱,采用全时段多波长融合技术,体积流量0.3 mL/min;柱温30℃。建立QBT的指纹图谱,并对各样品的指纹图谱进行相似度评价,结合聚类分析评价58批样品的质量,指认了指纹图谱中主要共有峰的化学成分并确定了其药材归属。结果首次建立QBT的UPLC指纹图谱,对其中16个共有峰进行了化学成分鉴定,分别是辛弗林(1号峰)、虎杖苷(2号峰)、金丝桃苷(3号峰)、新圣草苷(4号峰)、柚皮苷(5号峰)、橙皮苷(6号峰)、新橙皮苷(7号峰)、枸橘苷(8号峰)、朝藿定A(9号峰)、朝藿定B(10号峰)、朝藿定C(11号峰)、淫羊藿苷(12号峰)、芒柄花素(13号峰)、宝藿苷(14号峰)、大黄素(15号峰)、大黄素甲醚(16号峰),确定了16个特征峰来源于方中4味中药,峰1、4~8归属枳壳药材,峰2、3、15、16归属虎杖药材,峰9~12、14归属淫羊藿药材,峰13归属黄芪药材。对9个生产企业58批次样品进行相似度评价,相似度分布在0.600~0.912,通过聚类分析大致可聚为4类。结论建立QBT的指纹图谱,该方法简便、可靠,为进一步评价和监测QBT的质量提供参考。