外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和新霉素磷酸转移酶基因的重组质粒导入不结球白菜地方品种———“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”中 ,获得抗虫转基因植株。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代T1代植株中发生分离 ;在T2 代中出现 3种不同类型的株系 :抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代中的表现基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。从T2 、T3 、T4代中选择出抗虫性纯合株系 ,并获得一批对 1～ 2龄鳞翅目小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫的校正死亡率达 6 0

新霉素磷酸转移酶基因npt Ⅱ的原核表达、蛋白纯化及其活性鉴定

通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a(+)中,构建了重组质粒pET30a-nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35kD的表达蛋白,约占全菌总蛋白的45%。表达蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。用5mmol/L二硫苏糖醇和1%十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体,经透析后复性获得了可溶性重组蛋白。将可溶的表达蛋白用Ni 2+-NTA亲和层析纯化,获得纯化的NPTⅡ蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度达95%以上。体外活性检测显示,NPTⅡ蛋白具有良好的生物活性,在浓度30μg/mL以上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。

分泌蛋白特异性基因陷阱的设计与验证

蛋白质分子向细胞外分泌的过程有赖于信号肽的介导 .基因陷阱是功能性基因克隆的一种有效方法 ,经典的基因陷阱以geo作为报告基因 ,对所克隆的基因类型没有选择性 .将绿脓杆菌外毒素、 2A序列、IL 2受体穿膜区以及新霉素磷酸转移酶的基因依次融合构建新型报告基因——— peo ,该报告基因能够特异性地甄别具有信号肽编码序列的基因 .为验证 peo对信号肽编码序列的特异性甄别作用 ,以 peo为报告基因 ,构建了 3种质粒载体 ,分别模拟用基因陷阱载体进行筛选时可能出现的 3种情况 ,通过转染HeLa细胞、G4 18筛选以及碱性磷酸酶检测 ,证明 peo能够有效地区分信号肽和非信号肽编码序列 ,以 peo为报告基因改造的基因陷阱载体可以用于分泌蛋白基因的筛选 .

通用型动物转基因载体的构建及验证

为了构建通用型动物转基因载体,以pBluescriptⅡKS+为基础,根据标记基因所含酶切位点,设计改造多克隆位点,插入从pTARGET载体中扩增的SV40启动子及新霉素磷酸转移酶基因(Neo),其下游插入共表达序列、增强型绿色荧光蛋白质基因(EGFP)及SV40 poly A,并在SV40启动子上游和SV40 poly A下游各添加一个同向的LoxP位点,构建成通用载体pNIGFP,标记基因上游拥有Xho I、Sal I、SacⅡ多克隆位点,下游拥有Nhe I、Cla I、Sac I位点。酶切鉴定和测序表明pNIGFP构建正确。pNIGFP脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,荧光显微镜下观察到EGFP高表达。遗传霉素(G418)筛选表明,Neo基因表达正常,山羊胎儿成纤维细胞的最适筛选浓度为600"g/ml。pNIGFP可利用G418进行抗性筛选,还可通过EGFP表达对外源基因的整合进行实时跟踪,另外,该载体具有LoxP位点,外源基因整合后可用Cre重组酶去除标记基因,具有高效、方便、安全的特点。

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体。方法:设计扩增新霉素抗性基因neo,克隆入萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo。分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性。结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光素酶报告质粒pGL3-neo。G418筛选可获得稳定转染pGL3-neo细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株。荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMVpromoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMVpromoter组萤光素酶活性值分别为1047±86、1504±107和34819±1479、456109±15791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05。结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高。

人生长激素基因转化花叶芋及PEG在转化中的作用

将人生长激素基因插入pBR322衍生质粒载体pLGV1103 DNA中,通过三亲交配,将重组原粒pLB-9引入携带Ti质粒pGV3850的农杆菌,经同源重组,获得共整合重组体pGL198(hgh)Ti质粒。用叶盘共培养法,将pGL198(hgh)转化单子叶植物花叶芋,获得转基因再生植株。经胭脂碱测定、新霉素磷酸转移酶分析和DNA分子杂交,证明人生长素基因已整合到花叶芋DNA中。还探讨了聚乙二醇(PEG)在植物转化中的作用。

转基因植物中NPTⅡ的快速检测

将转基因植物组织提液与底物[r-32p]ATP和卡那霉素进行反应,再将磷酸化的卡那霉素转移到P81磷酸纤维素离子交换纸上,放射性标记的卡那霉素可通过斑点放射自显影进行观察。此法简便、快速,灵敏度较高。

无HindⅢ位点新霉素磷酸转移酶标记基因的建立

用体内自发突变，卡那霉素抗性筛选和体外限制酶切富集方法消除载体ｐＮＧ３５中新霉素磷酸转移酶基因内的限制酶位点ＨｉｎｄⅢ，除去ＨｉｎｄⅢ位点后的载体ＰＮＧ３５△Ｈ赋予宿主细胞的卡那霉素抗性水平远远高于原载体ｐＮＧ３５．

萤火虫萤光素酶基因转化花叶芋及表达的研究

将萤火虫萤光素酶基因重组到质粒pBR325中,通过“三亲交配”和同源重组,将萤光素酶基因整合到Ti质粒pGV3850:1103。通过改良的叶盘转化法,用萤光素酶基因转化单子叶植物花叶芋,获得转基因植株。对再生植株的胭脂碱测定、新霉素磷酸转移酶分析、DNA点杂交、萤光素酶基因活性测定,证明萤光素酶基因已转化到花叶芋中并进行了表达。

外源基因导入部分脱壁的大麦细胞及其转基因植株的再生

采用ＰＥＧ法、电击法以及ＰＥＧ＋电击法将带有ｇｕｓ和ｎｐｔⅡ基因的ｐＢＩ１２１质粒导入部分脱壁的大麦细胞，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＧＵＳ和ＮＰＴⅡ蛋白活性检测，证实了外源报告基因已在大麦基因组中整合并在转化细胞中获得表达．ＰＥＧ、电击及ＰＥＧ＋电击处理的最高转化率分别可达１６．４％、２１．８％和２５．１％，各种转化处理对植株再生并无不良影响，表明部分脱壁的细胞是一个比原生质体更为有效的转化受体系统．