绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害,目前没有可用的有效药剂和抗病品种,分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价,针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因,构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明,使用Es Taq MasterMix对感染Candidatus Liberibacter asiaticus(C Las)的柑橘样品进行常规PCR检测时,在评价的16对引物中,OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高,推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系,部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增,F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系,且最高可稳定特异检出10^(5)倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-3) ng/μL),是灵敏度最高的引物组,OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-2) ng/μL),是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中,pnrdB83扩增效率最接近100%,且在2次重复试验中波动最小,稳定性最强,并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时,各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小,是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。

犬弓形虫巢式PCR检测方法的建立及初步应用

弓形虫病是一种重要的人兽共患病,犬是弓形虫重要的中间宿主,有必要建立一种快速、灵敏的犬弓形虫病检测方法。根据GenBank中弓形虫529 bp基因重复序列设计巢式PCR引物,通过优化反应条件建立巢式PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫的基因扩增无条带;灵敏度试验结果显示,该方法最低可以检出0.134 pg的弓形虫基因,比目前国标PCR方法高100倍。对感染弓形虫犬的组织样品检测发现,巢式PCR能在感染犬的不同组织中检测出弓形虫基因。建立的犬弓形虫巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为该病的检测奠定了基础。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

一株猫艾滋病病毒的巢式PCR检测及亚型鉴定

为了进一步了解猫免疫缺陷病毒(FIV)的区域流行情况,试验采用巢式PCR方法对15份流浪猫全血样品进行FIV gag基因扩增,检测出FIV阳性样品后再通过巢式PCR扩增得到FIV env基因V3~V5高变区序列,应用DNAMAN软件对阳性样品env基因的V3~V5高变区序列与NCBI中收录的参考毒株进行比对,使用MEGA 7.0软件构建进化树并进行遗传进化分析。结果表明:检测出1份FIV阳性样品,将FIV阳性株命名为XM07毒株,该毒株的env基因V3~V5高变区序列与NCBI中C78毒株的核苷酸序列相似性达到97.57%,与SH-2363毒株的核苷酸序列相似性达到96.83%;XM07毒株与SH-2363毒株在同一进化分支中,鉴定为A亚型。说明试验鉴定的FIV毒株未发生明显变异。

超灵敏高特异性巢式PCR检测方法的建立及其在大黄鱼(Larimichthys crocea)弧菌病早期预警中的应用

由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)及溶藻弧菌(V.alginolyticus)等病菌感染导致的弧菌病是大黄鱼养殖中最常见、最具危害性的疾病之一,然而目前针对发病后的遏制手段有限,因此亟待建立高灵敏度、高特异性的病原检测技术以实现病害早期预警。在普通两轮巢式PCR引物的基础上,对这3种弧菌分别设计一套三轮巢式PCR引物,通过扩增条件优化、特异性检验及灵敏度测定,确定了能精准检测3种弧菌的方法,达到了扩增产物单一、参考菌假阳性检出率为0、靶序列最低检出灵敏度分别为2.50 copies/μL(哈维氏弧菌)、3.12 copies/μL(副溶血弧菌)、2.53 copies/μL(溶藻弧菌)等效果。利用开发的检测方法,检测了2021~2023年度浙江、福建一带大黄鱼养殖样本,所有样本均检测出哈维氏弧菌和溶藻弧菌,副溶血弧菌未检出。结果显示浙江、福建一带大黄鱼弧菌病主要是由哈维氏弧菌和溶藻弧菌引起。开发的检测方法有望应用于大黄鱼等养殖物种弧菌病的早期预警和常规检测。

应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究

以采自田间和广东省农业科学院果树研究所防虫隔离网室内嫁接并感染黄龙病的5个柑橘品种叶片为材料,以草本指示植物长春花(Catharanthusroseas)和木本指示植物柑(CitrusreticulataBlanco)鉴定为基础,采用改良的CTAB法提取总DNA,在此基础上进行常规PCR与NestedPCR检测,并对特异目的片段进行克隆、测序。试验证明NestedPCR比常规PCR的灵敏度更高。这两种方法均可以检测出未显症的黄龙病材料,但NestedPCR可以在木本指示植物嫁接后40d左右、草本指示植物摩擦接种1个月左右检测到病原;而常规PCR在木本植物嫁接后60d左右、草本植物摩擦接种近2个月左右才能检测到病原。常规PCR所能检测到的最低DNA的量为pg数量级;NestedPCR检测病原DNA灵敏度约为常规PCR的104倍。

广西砂糖橘黄龙病亚洲种的Nested-PCR检测

【目的】利用柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA序列的特异引物检测疑似黄龙病的砂糖橘叶片样品,为砂糖橘黄龙病的综合防控提供理论依据。【方法】选取采自广西9市17个采样点的214份疑似黄龙病及无症状砂糖橘叶片样品,用试剂盒法提取叶脉基因组DNA,采用柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA特异引物进行PCR扩增,扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,统计待检样品柑橘黄龙病病原菌亚洲种的带菌率。【结果】对214份样品的Nested-PCR扩增结果,部分样品可得到1160 bp左右的特异条带,与预期大小相符但条带明暗不同。来自广西9市17个采样点的砂糖橘叶片样品均检测出黄龙病亚洲种病原,平均检出率均在66.0%以上,其中检出率最高的是来自东兴市的样品,检出率为100.0%,检出率最低的是来自南宁市的样品,检出率为66.9%;斑驳、缺素型黄化、叶脉黄化、小叶和无症状叶片样品中均可检测出黄龙病亚洲种。【结论】Nested-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点,能够快速、准确检测出各种症状样品的黄龙病病原,可用于柑橘黄龙病的早期诊断。

进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定

为了查明锦鲤暴发性疾病的病因 ,将患病锦鲤的脑、肝、脾和肾等组织悬液接种到CO、CK和EPC等鱼类细胞系中培养 ,均未发现细胞病变 ;从病灶中取样进行病原菌的分离和培养 ,证明锦鲤有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的感染。制备锦鲤疱疹病毒 (KHV)的 2对引物KHV9/ 5F和KHV9/ 5R ,KHV1和KHV2 ,用嵌套式聚合酶链式反应 (nested -PCR)在脑和脾脏组织的抽提物中扩增出长度为 4 12bp的特异性的DNA片段。将该片段的nested -PCR扩增产物纯化后 ,克隆、测序。用NCBI -Blast软件将测序结果在Genebank中进行搜寻、比较 ,结果发现与注册号为AF4 1180 3的KHV基因序列的一部分片段有 99%的同源性。因此初步判断这次锦鲤暴发性疾病是由KHV引起的 。

蜜蜂囊状幼虫病毒病的Nest-PCR检测

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且危害严重的疾病,病原为一小正链RNA病毒。如何尽早鉴别蜂群的感染在养蜂业生产上具有重要的意义。本文报道一种利用RNA反转录结合巢式PCR检测鉴定蜜蜂的囊状幼虫病毒病的方法。

猪瘟病毒RT-nested PCR检测方法的优化和应用

为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳性毒和健康猪脾、肝组织及阴性PK-15细胞均未扩增出特异性条带,说明该方法特异性强。应用此方法对福建省133份病料进行检测,结果有60份病料为阳性,阳性率为45.1%。结果提示优化的检测方法灵敏度高,特异性强;福建省猪群CSFV感染率高,需要加强CSF预防控制工作。

16S nested-PCR技术检测玉米细菌性枯萎病菌(英文)

玉米细菌性枯萎病是玉米上的重要种传病害,病原菌为Pantoea stewartiisubsp.stewartii。本研究设计了16S通用引物,扩增该病菌及其近似种的16S rDNA,通过序列测定和分析,针对该病菌设计了特异性引物,采用nested-PCR技术,能够准确地区别该病菌及其近似种,检测的灵敏度在DNA水平上达到10-3pg级,检测活菌则达到2 cfu。检测人工污染的玉米种子时,不受种子提取液中其它物质的干扰,灵敏度依然达到2 cfu。

nested-PCR试剂盒检测牛精液中的布鲁氏菌DNA

目的布鲁氏菌是兼性细胞内寄生菌,能够在吞噬细胞内长期存活并繁殖,引起家畜流产和人的波浪热。根据病原性和感染宿主的不同将布鲁氏菌分为六个种,能否快速、有效地从各种病料中检出布鲁氏菌,对及时控制布鲁氏菌在家畜中的传播和预防对人的感染十分重要。方法2006年6月,宁夏某公司奶牛场工作人员送检3份奶牛冻干精液,用巢式PCR检测出其中的2份为布鲁氏菌感染阳性,这年8月,重复取这2头种公牛的冻精、鲜精复查。结果用本方法检测全部为布鲁氏菌感染阳性。结论这是国内首次用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)试剂盒从送检的牛精液中检出了布鲁氏菌DNA片段。

应用RT-nested PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的诊断方法。结果表明,RT-nestedPCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此方法简单省时、灵敏性高,可以作为检测RNA病毒的一种分子生物学方法。

大豆油中转基因成分的Nested PCR和Semi-nested PCR检测方法研究

对大豆油中DNA提取方法进行了研究,结果表明CTAB、SDS和Wizard试剂盒提取大豆油DNA均具有良好的效果。利用nested PCR和semi-nested PCR检测大豆(Roundup Ready)油中的转基因成分发现,该方法能够检测到大豆原油中的Lectin基因(112bp)、CaMV35S基因(147bP)和CP4-EPSPS基因(205bp),检测灵敏度达到10-6ng/μl;但该方法未能从人豆成品油(一级)中扩增到上述基因,当中的转基因成分DNA含量低于10-12ng/μl。

Nested-PCR检测种传番茄细菌性溃疡病菌

利用番茄溃疡病菌特异性引物对纯菌液、模拟带菌种子及自然感染种子提取液分别进行Direct-PCR和Nested-PCR检测。结果在纯菌液中,Direct-PCR的检测灵敏度为105cfu/mL,Nested-PCR为102cfu/mL;在模拟带菌种子提取液中,Direct-PCR的检测灵敏度为107cfu/mL,Nested-PCR为104cfu/mL;在自然感染种子提取液中,稀释104倍后Nested-PCR仍然可以检出。建立的番茄种子Nested-PCR检测技术,无需经过核酸提取步骤,可以在8 h内完成整个检测过程,方便快捷,成本低廉,可作为番茄种子带菌的常规检测方法。

应用套入式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测蓝舌病病毒的研究

本实验建立了一种Nested PCR方法。应用该方法检测 5株标准株蓝舌病病毒 (T4、T10、T11、T16、T2 0 )和 5株国内蓝舌病病毒分离株 (CF4、AF6、Z1、H1、G14) ,检测结果均为阳性 ,而检测相关环状病毒 (EHD2、EHD6、Ibraki) ,检测结果均为阴性。研究证明 ,此方法可检测到3 5fg的BTV—RNA ,灵敏度较高。该方法成功区分了蓝舌病病毒和相关环状病毒 ,比血清学方法更加优越 ,在临床检测方面具有广阔的应用前景。

蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术

【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank已报道的BlShV基因序列,设计一对外侧引物(BlShV-F/BlShV-R)和一对内侧引物(BlShV-1/BlShV-2),以感染BlShV的蓝莓病叶为材料,利用免疫IC-RT-PCR(免疫捕获RT-PCR)和nested PCR(巢式PCR)建立BlShV的IC-RT-nested PCR检测技术;分别以BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)和健康蓝莓叶片为对象,测定该检测技术的特异性;将BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后连接到pMD18-T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,进行测序和序列比对验证该检测技术的准确性;将感染BlShV的蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,测定该检测技术的灵敏度,并与DAS-ELISA方法相比较;利用建立的IC-RT-nested PCR对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品(53份)和进境美国蓝莓叶片(15份)进行实际检测,并对上述样品采用普通RT-PCR方法进行验证。【结果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功从感染BlShV病叶提取液第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,未从健康蓝莓叶片提取液和空白对照扩增出目的片段;特异性测定结果表明,IC-RT-nested PCR具有良好的特异性,仅从感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR分别扩增到目的片段,而从BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液第1轮、第2轮均未扩增到相应的目的片段;序列分析结果显示,感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR产物的序列同预期大小完全一致,分别为746、486 bp,将获得的两轮PCR产物序列与GenBank数据库中的BlShV基因序列进行比对,结果显示第1轮、第2轮PCR产物的序列与已报道的BlShV核苷酸序列一致性均达99%,证实两轮PCR产物均为BlShV特异性产物,进一步验证了扩增结果的准确性;灵敏度测定结果表明,IC-RT-nested PCR的第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,灵敏度与DAS-ELISA相当,经过第2轮PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液;蓝莓样品IC-RT-nested PCR测定结果显示,2份来自于美国的蓝莓叶片样品扩增出大小约486 bp的目的片段,BlShV检出率为13.3%,而中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品上均未扩增出相应的目的片段,未检测到BlShV,该检测结果与普通RT-PCR验证结果完全相符,表明建立的IC-RT-nested PCR能够用于蓝莓样品的实际检测。【结论】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特异、准确和灵敏的优点,适合于田间和进出境口岸蓝莓样品上BlShV的检测鉴定。

用Nested-PCR检测广西黄皮与九里香黄龙病病原

运用Nested-PCR技术对来自广西部分市、县的40个黄皮和九里香进行柑桔黄龙病(CitrusHuanglongbing,HLB)病原检测,结果表明:从部分黄皮和九里香样品抽提的DNA中,可扩增出一条特异性的400bp条带,说明广西种植的黄皮和九里香均可感染黄龙病;在柑桔黄龙病疫区,黄皮和九里香黄龙病感染率分别为35.0%和40.0%,黄龙病感染率已相当高。为了减少柑桔黄龙病的发生,有利于对柑桔黄龙病进行综合防控,不宜在柑桔种植区栽种黄皮和九里香,铲除已感染黄龙病的植株。

应用RT-nested-PCR检测犬唾液中狂犬病毒的初步研究

目的建立RT-nested-PCR方法,用于检测可疑狂犬唾液中的狂犬病毒,为狂犬病的快速诊断提供一种新思路。方法根据N基因的保守区序列设计2对引物,通过反应条件的优化,建立RT-nested-PCR的方法,以扩增狂犬病毒的N基因,并用该方法检测可疑狂犬唾液中的狂犬病毒。结果该方法的最小RNA检出量可达11.2fg,并具有较好的特异性和重复性。结论建立的RT-nested-PCR检测法,特异性强,敏感度高,结果可靠,操作便捷,值得推广应用。