蜜蜂囊状幼虫病毒病的Nest-PCR检测

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且危害严重的疾病,病原为一小正链RNA病毒。如何尽早鉴别蜂群的感染在养蜂业生产上具有重要的意义。本文报道一种利用RNA反转录结合巢式PCR检测鉴定蜜蜂的囊状幼虫病毒病的方法。

HIV-1包膜单基因Nest-PCR体系优化及包膜基因准种扩增

目的确定HIV-1包膜(envelope,env)单基因扩增(single genome amplification,SGA)的最优反应体系,获得env单基因扩增产物。方法采用SGA及Nest-PCR扩增HIV-1 env全长基因,并对Nest-PCR反应体系中各成分量进行优化;在此基础上,适当稀释HIV-1感染者cDNA模板进行Nest-PCR,以获得PCR扩增产物阳性率不超过30%的模板稀释度。结果 SGA Nest-PCR扩增HIV-1 env全长基因,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.25μmol/L时可获得特异性高的env全长基因;凝胶回收纯化及稀释第一轮PCR产物可有效提高特异性条带的产量。采用优化反应体系成功从一名HIV-1感染者体内扩增出18株env单基因序列。结论优化了HIV-1 env基因SGA Nest-PCR的反应体系,并从HIV-1感染者获得了病毒包膜基因准种,为后续进行准种分析奠定了基础。

血清登革热病毒NEST-PCR检测

目的 建立用NEST—PCR快速检测登革热病毒的方法。方法 通用引物对样本进行RT—PCR扩增，然后用分型引物进行NEST—PCR，根据产物条带的位置分型。结果 标准毒株的扩增结果与预期结果相同，血清登革热病毒在病程2～5d的阳性率高于6～9d的阳性率，分别为6／7和2／6。结论 NEST—PCR方法是一个快速、准确检测登革热的方法，但它更适用于早期临床检测。

应用RT-nest-PCR法检测慢性髓细胞白血病非亲缘异基因骨髓移植后微小残留病变

目的:应用筑巢式RT—PCR(RT—nest—PCR)法检测慢性髓细胞性白血病(CML)患者非亲缘异基因骨髓移植(URD)后微小残留病变(MRD),并探讨它与复发的相关性。方法:分别采用RT-nest-PCR法和常规细胞遗传学方法检测bcr／abl融合基因和Ph染色体。结果:20例CML行URD患者术前Ph染色体和bcr／abl融合基因检测均为阳性,移植术后30 d Ph染色体皆转为阴性,bcr／abl融合基因完全转阴时间为1～3个月,中位时间2个月;在随防的18例CML患者中,有16例患者bcr／abl融合基因完全转阴后没再转为阳性。在1例复发的CML患者中可见到血型、Ph染色体和bcr／abl融合基因动态变化,另1例CML患者在移植成功后的21个月和36个月检测到bcr／abl融合基因,经随访未见临床和血液学复发征象。结论:检测ber／abl融合基因是目前观察CML患者非亲缘异基因骨髓移植后微小残留病变最敏感的方法之一,非亲缘异基因骨髓移植能最大限度地消除CML患者体内残留病变,患者能长期无病生存。

HBsAg ELISA+/HBV DNA NAT-献血者血清学与分子生物学特征分析

目的 了解西安地区无偿献血人群HBsAg ELISA检测结果与HBV DNA检测结果不一致的标本相关血清学标志物的分布情况。方法 收集2022年11月1日—2023年4月30日陕西省血液中心HBsAg ELISA+/HBV DNA NAT-(ELISA+/NAT-)标本共计71份,对其采用电化学发光法检测乙肝血清学标志物,同时复检巢式PCR扩增HBV S区和C区基因片段。结果 双ELISA+/NAT-标本(n=30)巢式PCR检测阳性率远高于单ELISA+/NAT-标本(n=41)(60%vs 24.40%,P<0.05)。前者献血者100%为初次献血者,血清抗-HBc阳性率100%,血清学模式以1、4、5此3项阳性(80%)为主;后者献血者中31.7%为重复献血者,血清抗-HBc阳性率仅为19.51%,血清学模式以单2项阳性(43.90%)和全阴(36.58%)为主。结论 单ELISA+结果存在较多假阳性,导致不必要的血液报废;而NAT-标本可能存在低水平的HBV DNA,产生漏检风险。建议针对单HBsAg ELISA+/NAT-献血者,采用多套系统多种方法追溯检测,提高献血者HBV筛查的准确度,减少不必要的血液浪费。

宁夏地区奶牛源隐孢子虫分子鉴定与分析

为了明确宁夏地区奶牛隐孢子虫的流行情况及其优势基因型,采集宁夏4个地区10个规模化奶牛养殖场中1174份奶牛粪便样品,基于核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)基因通过套式PCR进行检测和分析。结果显示,宁夏地区奶牛隐孢子虫阳性率为28.5%(335/1174);共鉴定出4种虫种,即微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫,阳性率分别为40.6%(136/335)、36.1%(121/335)、19.4%(65/335)和3.9%(13/335);微小隐孢子虫共鉴定出4种基因亚型,分别为ⅡdA15G1(n=70)、ⅡdA18G1(n=26)、ⅡdA19G1(n=23)和ⅡdA20G1(n=17)。统计学分析显示,在宁夏地区,0~2月龄的犊牛隐孢子虫感染率最高,且奶牛隐孢子虫的感染率与月龄差异显著相关(P<0.001)。表明宁夏地区奶牛存在隐孢子虫感染且存在人畜共患虫种,ⅡdA15G1微小隐孢子虫是宁夏地区奶牛感染的优势亚型。

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害,目前没有可用的有效药剂和抗病品种,分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价,针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因,构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明,使用Es Taq MasterMix对感染Candidatus Liberibacter asiaticus(C Las)的柑橘样品进行常规PCR检测时,在评价的16对引物中,OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高,推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系,部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增,F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系,且最高可稳定特异检出10^(5)倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-3) ng/μL),是灵敏度最高的引物组,OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-2) ng/μL),是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中,pnrdB83扩增效率最接近100%,且在2次重复试验中波动最小,稳定性最强,并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时,各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小,是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。

犬弓形虫巢式PCR检测方法的建立及初步应用

弓形虫病是一种重要的人兽共患病,犬是弓形虫重要的中间宿主,有必要建立一种快速、灵敏的犬弓形虫病检测方法。根据GenBank中弓形虫529 bp基因重复序列设计巢式PCR引物,通过优化反应条件建立巢式PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫的基因扩增无条带;灵敏度试验结果显示,该方法最低可以检出0.134 pg的弓形虫基因,比目前国标PCR方法高100倍。对感染弓形虫犬的组织样品检测发现,巢式PCR能在感染犬的不同组织中检测出弓形虫基因。建立的犬弓形虫巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为该病的检测奠定了基础。

长沙生态动物园野生动物衣原体感染情况调查

为了解长沙生态动物园野生动物衣原体的感染情况,本试验根据中华人民共和国农业行业标准(NY/T 562—2015),采用巢式PCR方法对采集到的园区内63种动物的231份粪便样品进行衣原体检测,并对阳性样品进行测序分析。结果显示,所有检测样品中有13份样品呈衣原体阳性,总阳性率为5.63%(13/231),其中植食类动物阳性率为11.43%(4/35)、灵长类动物阳性率为13.95%(6/43)、禽鸟类动物阳性率为3.13%(2/64)、肉食类动物阳性率为1.12%(1/89)。所有动物中感染风险最大的是灵长类动物,11种灵长类动物中有5种检出阳性,占比45.45%,且优势比(OR)=4.19(P<0.01)。基因测序和比对结果显示,仅从1份绿孔雀阳性粪便样品中获得有效的衣原体序列(序列号:OK033359.1),其与美国分离株c149(序列号:KY206900.1)相似度达99.72%,可鉴定为Chlamydia gallinacea,且处于较早进化阶段。结果表明,该动物园存在衣原体感染,但感染率不高,感染风险最大的是灵长类动物,禽鸟类存在Chlamydia gallinacea感染。衣原体在生态动物园野生动物中的存在对人类健康存在潜在威胁,应引起重视。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

大连地区养殖日本囊对虾5种病原携带情况调查

为探明大连主养区日本囊对虾血细胞虹彩病毒、白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌和肝肠胞虫的携带情况,对2019年9月采集自辽宁省大连市城子坦、青堆、仙浴湾等8个主养区的日本囊对虾样本进行了5种病原的PCR检测。结果显示:日本囊对虾携带的主要病原依次为白斑综合征病毒、血细胞虹彩病毒、肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒和急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌,其阳性检出率分别为9.99%、4.30%、3.74%、2.24%和1.05%;此外,城子坦地区对虾的白斑综合征病毒和急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌携带率最高,青堆、仙浴湾和石河对虾的血细胞虹彩病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒和肝肠胞虫阳性率最高。本调查结果可为大连地区养殖日本囊对虾病原控制策略的制定提供参考依据。

基于PCR和巢式PCR技术的玉米南方锈病早期检测

【目的】建立巢式PCR方法,快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌(Puccinia polysora),为玉米南方锈病(southern corn rust)的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列,在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R,建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系:Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL~(-1))0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg~(2+)plus)2μL,d NTP Mixture(各2.5 mmol·L~(-1))1.6μL,上下游引物(10μmol·L~(-1))各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH_2O。扩增程序:利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环;72℃再延伸7 min。将扩增后的产物稀释20倍,取1μL用作第二步PCR的扩增模板,然后以内侧引物NX255-F/NX255-R进行第二步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,66℃退火30 s,72℃延伸26 s,30个循环;72℃再延伸7 min。同时选用内侧引物进行常规PCR扩增,扩增体系同巢式PCR,扩增程序除循环数为38,其余程序同巢式PCR的第二步PCR检测。在此条件下对多堆柄锈菌、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、青杨叶锈病菌(Melampsora laricipopulina)和7种玉米常见病原菌进行特异性检测,对不同梯度多堆柄锈菌基因组DNA和3种人工接种病叶进行灵敏度检测。【结果】巢式PCR检测体系仅在检测多堆柄锈菌时,产生了255 bp的目的条带,其他菌株均未扩增出目的条带。巢式PCR检测体系对多堆柄锈基因组DNA的最低检测限为10 fg·μL~(-1),是常规PCR检测体系灵敏度的500倍。当1 g人工接种病叶含500—2.5×10~4个多堆柄锈菌夏孢子时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别0和85.71%,巢式PCR可检测出的夏孢子个数最少为1 000个;当1 g人工接种病叶中含1—7个夏孢子堆时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别76.19%和100%,常规PCR可检测出的夏孢子堆个数最少为2个,巢式PCR可检测出1个及以上夏孢子堆;当1 g人工接种病叶中含1—7个侵染点时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别14.29%和66.67%,检测出的侵染点个数最少分别为6个和3个。【结论】成功建立了一种以NX471-F/ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR检测方法,可快速、高效、准确检测玉米叶片中潜伏期的多堆柄锈菌。

咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用

由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害,建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对,通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后,进一步对单管巢式PCR检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验,从而建立高效的单管巢式PCR检测反应体系。结果表明,咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为63℃与52℃。正交试验显示,在20μL的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10×rTaq Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 3.2μL,rTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1.8μL,7μmol/L的HvF2/HvR2各1μL,1nmol/L的HvF1/HvR1各1μL,模板DNA1μL,ddH207.5μL。所建立的单管巢式PCR检测体系具有高度特异性,能从含有咖啡叶锈病菌DNA模板中检测出特异性条带,而其他供试的非咖啡叶锈病菌DNA模板中扩增不出任何条带。该检测技术体系的最低检测限为5 fg/μL,是普通PCR灵敏度的100倍。采集的22份早期疑似病样经检测鉴定均含有咖啡驼孢锈菌。本试验建立的单管巢式检测技术可用于咖啡叶锈病菌的快速鉴定,可用于病害监测预警。

斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR检测

旨在建立一种快速、可靠的斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒(Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)的分子检测方法,以克服目前常规PCR技术很难检测到斜纹夜蛾成虫带病毒的缺陷。以SpltNPV的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,egt)基因为检测对象,基于该基因序列设计了巢式PCR引物,其中一对外侧引物egt-F/R和一对内侧引物egt1-F/R,并研究斜纹夜蛾成虫带毒的巢式PCR检测可靠性。结果表明:基于egt基因的巢式PCR方法可以特异性扩增SpltNPV的DNA,引物egt-F/R的扩增检测最低限为10-7μg/μL;且基于引物egt-F/R的两轮普通PCR无法检测出成虫带毒,而采用巢式PCR方法可有效扩增出目的egt片段,巢式PCR检测方法的灵敏度比两轮普通PCR检测方法提高2个数量级。因此,本研究成功建立了基于SpltNPV的egt基因的巢式PCR检测技术,该方法为斜纹夜蛾成虫带毒、传毒等流行病学研究提供了可靠的技术支撑。

巢式PCR-HRM法在点突变模式小鼠基因分型中的应用

目的利用巢式PCR结合高分辨率熔解曲线(HRM)技术,改进点突变模式小鼠的基因分型方法。方法以ob/ob鼠和db/db鼠为样本,剪小鼠脚趾编号并提取基因组DNA。根据突变位点参考序列设计巢式PCR引物并进行两轮扩增后,对产物进行HRM分析,获得基因分型结果。同时,通过PCR-SBT法和PCR-RFLP法对分型结果的准确性进行验证。结果对80只ob/ob鼠和65只db/db鼠进行了检测,巢式PCR-HRM法能够准确地分辨出3种基因型。在ob/ob鼠中,鉴定得到的纯合子、杂合子和野生型分别为21、47和12只。而在db/db鼠中,纯合子、杂合子和野生型分别为23、33和9只。巢式PCR-HRM法的分型结果与PCR-SBT法和PCR-RFLP法的结果高度一致,且分型结果与小鼠表型一致。结论建立的巢式PCR-HRM法是一种快速、简便、准确度高的基因分型方案,适用于大批量点突变模式小鼠的基因分型鉴定。

基于巢式PCR技术对玉米种子携带禾谷镰刀菌的检测体系

禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)是真菌性玉米茎基腐病的主要致病菌之一,为了减少种子带菌对该病害的传播,本研究采用巢式PCR技术构建玉米种子检测体系,并对其进行特异性、灵敏度和可行性检测。结果表明,该体系可有效检测到玉米(Zeamays)种子携带禾谷镰刀菌的情况,灵敏度达4.224 pg·μL^(-1),是一种快速、灵敏、特异性强的检测体系,为玉米茎基腐病种子带菌检测、早期诊断和及时防治提供技术支持和理论依据。本研究是运用巢式PCR技术检测玉米茎基腐病主要致病菌-禾谷镰刀菌在国内的首次报道。

饲料禁抗背景下规模化猪场胞内劳森菌的流行病学调查

为掌握在饲料禁抗和养殖端限抗背景下规模化猪场胞内劳森菌的流行情况,为猪增生性肠炎的精准防控提供依据。该研究运用巢式PCR和间接ELISA方法对饲料禁抗后不同来源的粪便样品和血清样品进行检测。饲料禁抗背景下,对采自不同猪场695份粪样的巢式PCR检测显示,猪群胞内劳森菌的总体感染率为23.88%,保育猪、肥育猪和种猪感染率分别为16.56%、29.58%和24.63%。对饲料禁抗和饲养期间限抗猪群的跟踪调查结果为,保育猪在30、44、58、72日龄的感染率分别是16.67%、20.00%、50.00%和70.00%;后备母猪的感染率44.44%—66.67%。对338份不同猪场送检血清样品的ELISA检测显示,胞内劳森菌的抗体阳性率为42.6%,不同猪场的阳性率10%—75.90%。上述结果表明,现阶段我国规模化猪场胞内劳森菌PCR检测阳性率和ELISA检测的阳性率均处于较高水平。饲料禁抗以及饲养期间限抗的保育猪和后备母猪群跟踪调查的最高感染率分别达70%和66.67%,保育猪随着饲养日龄的增加感染率呈明显地升高趋势。因此,在饲料禁抗背景下,规模化猪场应更加重视猪增生性肠炎的防控。

广西西南部分地区龟隐孢子虫感染情况调查与分析

目的了解广西西南部分地区4种龟类隐孢子虫的感染情况。方法采集4个种类总计148只龟的粪便样品,利用巢氏PCR对18S rRNA基因进行检测和分析。结果龟隐孢子虫总感染率为23.65%(35/148),其中黄额闭壳龟感染率为35.29%(6/17),地龟感染率为29.00%(29/100),黄缘闭壳龟(0/16)和木纹龟(0/15)中未检测出隐孢子虫感染,两种龟类隐孢子虫检测结果均为阴性,感染率为0。不同龟种中,地龟感染了Cryptosporidium.ducismarci,黄额闭壳龟存在Cryptosporidium.ducismarci与Cryptosporidium.testudinis两种隐孢子虫的混合感染。结论广西西南部分地区龟类存在两种隐孢子虫的感染,且C.testudinis隐孢子虫可能对人兽健康存在潜在风险,本研究为明确目前广西西南地区的龟隐孢子虫的流行情况提供了参考依据。

小豆锈病分子检测体系的构建及应用

由豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae Barclay)引起的小豆锈病是小豆生产中危害最为严重的病害之一,建立早期分子检测技术体系对病害早期诊断和及时防控具有重要意义。本研究以豇豆单胞锈菌ITS序列为依据设计引物,结合已报道的单胞锈菌属特异检测引物,以豇豆单胞锈菌为目标菌,以茄链格孢、茄丝核菌、禾谷镰刀菌、稻瘟菌、苹果轮纹病菌、半裸镰刀菌、玉米链格孢菌、尖孢镰刀菌和禾顶囊壳等9种常见植物病原真菌为参照菌,采用CTAB法提取上述各菌株的基因组DNA,应用普通PCR技术筛选出豇豆单胞锈菌的特异性检测引物UV-ITS,在此基础上设计巢式PCR引物UV-MX,构建了基于巢式PCR的高灵敏度小豆锈病分子检测体系。该巢式PCR体系在基因组DNA浓度仅为4×10^(-6)ng·μL^(-1)时仍可实现有效扩增,其灵敏度是普通PCR的10万倍。以感病小豆品种‘宝清红’接种锈菌后不同时间的叶片为材料检验检测体系的应用效果发现,接种后12 h的小豆叶片样本即可扩增出豇豆单胞锈菌的特异性条带。本研究建立的小豆锈病分子检测体系特异性强、灵敏度高,具备对潜伏期病害进行早期诊断的应用潜力,可为小豆锈病的早期快速诊断和及时防控提供重要的技术支撑。