纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR法检测胰腺癌外周血微转移的敏感度及特异性

目的:通过胰腺癌外周血微转移模型,探讨纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR检测微转移的敏感度及特异性。方法:将胰腺癌细胞PANC-1稀释分别加入到正常人外周血单核细胞中,再按比例加入Fcλ非特异性受体阻断剂以及上皮细胞EP-CAM抗体,4℃下混匀孵育30 min,经分选柱阳性分选后提取RNA,RT-nest-PCR法检测肿瘤基因人端粒酶亚单位(h-TERT)和癌胚抗原(CEA)。结果:联合纳米免疫磁珠和RT-nest-PCR,平均1×107外周血单核细胞可以检测到1个肿瘤细胞。10例良性疾病对照组均未见表达。结论:免疫磁珠联合RT-nest-PCR是敏感度及特异性都较高的检测微转移的方法,可显著提高肿瘤微转移的早期检测率。

Ph^+/bcr-abl^+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph+ /bcr abl+ 急性淋巴细胞白血病 (ALL)患者的微小残留病变 (MRD)的简便而灵敏的方法 ,对 84例初治ALL患者和其中的缓解期患者的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT PCR检测。结果表明 ,缓解期患者骨髓中不存在Ph′染色体 ,巢式RT PCR方法检测到 11/ 14例缓解期患者存在MRD(bcr abl融合基因 ) (阳性率 78 5 7% ) ,而流式细胞术检测到 5 / 14的缓解期患者阳性 (阳性率 35 71% )。巢式PCR的灵敏度达到 10 -6- 10 -7水平 ,流式细胞检测的灵敏度达到 10 -4- 10 -5水平。结论 :Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏 ,而巢式RT PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高 ,且更易于开展应用。

食管癌患者外周血中CK19mRNA、CYFRA21-1、TPS联合检测的临床意义

目的评价食管癌患者外周血中微转移基因标记物细胞角蛋白19(CK19)mRNA和细胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、组织多肽特异性抗原(TPS)联合测定的临床价值。方法取48例食管癌患者术前外周血标本,应用巢式逆转录聚合酶链反应法(nested-PCR)检测外周血单个核细胞CK19 mRNA的表达,同时采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定患者血清CYFRA21-1和TPS水平。结果食管癌患者外周血中CK19 mRNA和血清CYFRA21-1和TPS的阳性检出率分别为52.1%、83.3%和66.7%。联合检测CK19 mRNA、CYFRA21-1和TPS在食管癌患者中的阳性表达,发现其与患者肿瘤细胞分化程度、浸润深度、临床分期及有无淋巴结转移和远处转移等有相关性(P<0.05或P<0.01)。结论在食管癌患者的随访中开展外周血中CK19 mRNA和血清CYFRA21-1和TPS的联合检测可提高食管癌微转移的检出率,以及时监控患者的病情。

应用巢式RT-PCR检测原发性肝细胞癌患者外周血中的微转移

目的 以AFPmRNA为标志基因 ,检测原发性肝细胞癌患者外周血中微转移情况。方法 应用巢式RT PCR方法 ,检测 71例肝细胞癌、2 1例肝硬化患者、2 8例健康对照、4例转移性肝癌、4例肝脓肿、4例肝血管瘤及 5例其它恶性肿瘤患者外周血中AFPmRNA的表达。结果 71例肝癌患者中 ,AFPmRNA阳性 3 9例 ,阳性率为 5 4.9% ,其中 8例有远处转移的全部阳性 ( 10 0 % ) ,未发现远处转移者阳性 3 1例 ,阳性率为 49.2 %。 2 1例肝硬化患者中仅 2例阳性 ,而转移性肝癌、肝血管瘤、肝脓肿、其它恶性肿瘤、健康对照均为阴性。结论 检测肝细胞癌患者外周血中的AFPmRNA ,是一种早期发现肝细胞癌血道播散的灵敏方法。

湖南省家犬感染狂犬病病毒状况调查研究

为了解湖南省家犬狂犬病病毒(RV)的感染状况,为防制狂犬病提供科学依据。本研究于2005年11月～2008年3月选择在全省18个县(市)收集市售家犬的脑组织标本,采用直接免疫荧光法(DFA)初筛检测RV抗原和套式RT-PCR方法检测RV特异性核酸进行确证。共检测家犬脑1613份,结果表明家犬RV感染率为4.15%。其中,雄性、雌性家犬RV感染率为4.68%和2.85%(p>0.05);大型、中型家犬RV感染率为4.57%和3.02%(p>0.05);成年犬、幼犬RV感染率为4.95%和1.57%(p<0.01);有、无狂犬疫苗免疫史的家犬RV感染率分别为1.29%、4.63%(p<0.05);春、夏、秋、冬季家犬RV感染率为9.56%、7.53%、2.31%、3.23%(p<0.01)。2005年～2006年、2007年～2008年各监测点家犬RV感染率分别与2006年、2007年人狂犬病发病率呈正相关(p<0.05)。检测结果表明湖南省家犬RV感染率较高(4.15%),存在地区、季节差异,而且家犬RV感染率与人狂犬病发病率呈正相关。

WT1基因在恶性造血系统疾病儿童中的表达及其意义

目的探讨WT1基因在儿童恶性造血系统疾病中表达的意义。方法采用巢式RT-PCR观察104例恶性造血系统疾病患儿WT1基因表达的相对水平;其中男69例,女35例;年龄1.5～14.0岁;同期检测72例成人恶性造血系统疾病患者作比较,选择12例健康体检者及10例非恶性造血系统疾病患儿骨髓标本或外周血作阴性对照(男9例,女13例;年龄3～12岁)。结果68例急性白血病(AL)患儿中WT1阳性表达49例(72.1%),3例慢性粒细胞白血病(CML)表达阴性,23例恶性淋巴瘤中7例阳性(30.4%),10例骨髓增生异常综合征(MDS)中阳性3例(30.0%),AL与MDS、CML及恶性淋巴瘤WT1阳性表达率比较差异均有显著性意义(Pa<0.01);而在健康体检者及造血系统非恶性造血系统疾病患儿中均表达阴性。各组与成人患者比较无年龄上差异(Pa>0.05),WT1基因表达在ALL均阴性,与急性粒细胞白血病(ALL)比较无显著性差异,在MDS中难治性贫血组显著低于原始细胞增多性难治性贫血及转化型原始细胞增多性难治性贫血(Pa<0.05)。结论WT1基因在恶性造血系统疾病患者中高表达,可作为检测AL微小残留及预测复发的肿瘤标志物;其与MDS疾病进程关系密切,并可作为对MDS疾病发展的高危评估指标之一。

癌胚抗原信使核糖核酸在不同类型肺癌组织中的表达

目的 比较不同类型肺癌组织表达癌胚抗原信使核糖核酸 (CEAmRNA)的差别 ,评估检测组织标本CEAmRNA指标在诊断与鉴别诊断肺癌方面的应用价值。方法 选取肺癌组织为研究对象 ,非癌性疾病的肺病变组织为对照 ,应用反转录套式聚合酶链反应 (RT NP PCR)技术检测CEAmRNA。结果 肺癌组总体表达CEAmRNA的阳性结果为 6 6 / 76 (86 .8% ) ,其中 ,不同类型肺癌组织表达CEAmRNA的阳性结果分别为 :腺癌 2 2 / 2 5 (88.0 % )、鳞癌 19/ 2 2 (90 .5 % )、腺鳞癌 8/ 8(10 0 % )、小细胞癌 10 / 12 (83.3% )、大细胞未分化癌 7/ 9(77.8% )。对照组织有 2例阳性发现 (8.0 % )。结论 各类肺癌组织表达CEAmR NA的结果明显高于非肺癌组织 (P <0 .0 0 1) ,检测肺组织标本CEAmRNA指标对诊断肺癌具有较高的应用价值 (特异性为92 .0 %、敏感性为 86 .8% )。

儿童急性淋巴细胞白血病常见融合基因的检测及意义

目的建立逆转录-巢式PCR检测融合基因的方法,检测4种常见融合基因在儿童急性淋巴细胞白血病中阳性率,并对阳性患儿进行初步临床资料分析。方法对收治的92例初发的急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿,于化疗开始前抽取骨髓标本1.5～2.0 ml,采用巢式RT-PCR方法检测最常见的4种融合基因:TEL/AML1、E2A/PBX1、m-BCR/ABL和AF4/MLL。结果92例ALL患儿中TEL/AML1阳性21例,阳性率22.8%,占B细胞性ALL的24.7%(20/81例);6例E2A/PBX1阳性(6.5%),在前B细胞性ALL中占20.0%(3/15例);2例AF4/MLL阳性(2.2%),在婴儿ALL中占33.3%(2/6例);仅检测到1例m-BCR/ABL阳性(1.1%)。结论巢式RT-PCR方法是检测融合基因有效、敏感的方法。TEL/AML1在儿童ALL中阳性率最高,尤其是在B细胞性ALL中,该融合基因阳性的患儿病情较轻。

PRXⅡ蛋白及mRNA在小鼠卵巢不同发育阶段的表达

目的:探讨PRXⅡ在小鼠卵泡发育不同阶段的表达。方法:选择不同发育时期的昆明小鼠卵巢,用免疫组化SP染色法,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同发育期卵巢组织中PRXⅡ蛋白、mRNA的表达水平。结果:PRXⅡ蛋白在各级卵泡的卵母细胞及颗粒细胞中均有表达,其表达水平随卵泡发育逐渐增强。始基卵泡与初级、次级、窦状卵泡相比,其卵母细胞及颗粒细胞中PRXⅡ蛋白表达水平明显较低,差异有统计学意义(P<0.005)。初级卵泡分别与次级、窦状卵泡相比其颗粒细胞中PRXⅡ蛋白表达水平较低,有显著差异(P<0.005)。闭锁卵泡PRXⅡ蛋白呈强阳性表达,明显高于生长卵泡中的表达水平。黄体及间质中亦见少量PRXⅡ表达。PRXⅡmRNA在卵巢组织中的表达水平随卵巢的生长发育呈先增高后降低的趋势。3、6、11周小鼠卵巢中PRXⅡmR-NA表达水平无统计学差异(P>0.05),但其表达水平是8天及15周小鼠卵巢组织的两倍。结论:卵泡发育不同阶段PRXⅡ均有表达,在卵泡发育后期和闭锁卵泡中强表达,提示PRXⅡ在卵泡的生长发育及闭锁过程中可能起重要的调控作用。

贵州省及部分周边地区牛博尔纳病病毒感染的情况调查

目的探讨贵州省及周边地区牛群博尔纳病病毒(BDV)感染状况。方法采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测了120例牛的外周血单个核细胞中的BDV p24基因片段。结果牛外周血单个核细胞(PBMCs)中BDVp24基因片段阳性率均为4.17%。牛BDV p24基因片段的测序结果与GeneBank提供的标准病毒株比较,同源性96.51%～97.67%;有2个位点出现一致性沉寂突变(nt1675C-T,nt1678T-C突变率为2%);与马的Strain V病毒株比较,有3个位点出现一致性沉寂突变(nt1650T-C,nt1671C-T,nt1674C-T突变率为3%);与H1766病毒株比较,有2个位点出现一致性沉寂突变(nt1675C-T,nt1678T-C突变率为2%);与He80/FR病毒株比较,在3个位点出现一致性沉寂突变(nt 1660T-C,nt 1669A-G,nt 1672C-T突变率为3%);但它们所编码的氨基酸没有改变。结论贵州及湖南省部分地区牛群中存在BDV自然感染,可能是BDV流行区域之一;人感染BDV可能具有潜在的动物源性。

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。

病毒性脑炎的诊断及博尔纳病病毒p24基因片段的检测

目的探讨脑脊液(CSF)、脑电图(EEG)、MRI对于病毒性脑炎的诊断价值,并检测病毒性脑炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)中博尔纳病病毒(BDV)p24基因片段,探讨病毒性脑炎与BDV感染的关系。方法回顾性分析病毒性脑炎患者的CSF、EEG、MRI的阳性检出率并进行比较,用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测病毒性脑炎患者及对照者PBMCs中BDVp24基因片段,并总结阳性患者的临床特征。结果CSF、EEG、MRI检查结果比较,CSF高于MRI检查结果阳性率(χ2=9.6,P<0.01);CSF高于EEG检查结果阳性率(χ2=7.58,P<0.01);MRI检查阳性率高于EEG(χ2=5.82,P<0.01)。PBMCs中BDVp24基因片段检测结果显示实验组4例阳性,对照组均为阴性。4例BDVp24基因片段阳性患者主要以发热、头痛、颅内压增高症状为主。结论脑脊液、MRI对病毒性脑炎的诊断价值优于EEG,部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关,主要以发热、头痛、颅内压增高为临床特征。

希罗达对人肝癌组织AFP mRNA表达影响的实验研究

目的 探讨希罗达 (Xeloda)对人肝癌组织AFPmRNA表达的影响。方法 抽提所收集的希罗达治疗组及对照组肝癌组织标本总RNA(共 4 1例 ) ,采用逆转录巢式聚合酶链反应 (RT nestedPCR)技术检测希罗达治疗组及对照组AFPmRNA的表达情况。结果 以RT nestedPCR扩增的AFP基因片段为 10 1bp ,与原设计一致。在希罗达治疗组中 ,2 1例肝癌组织标本中有 12例AFPmRNA呈阳性表达 ,阳性率为 5 7.14 % ;在对照组中 ,2 0例肝癌组织标本中有 18例AFPmRNA呈阳性表达 ,阳性率为 90 .0 0 % ,两者间差异有显著性意义 (P<0 .0 5 )。术后 4周 ,希罗达治疗组血清AFP浓度为 ( 2 3.2± 12 .8) μg/L ,明显低于对照组的 ( 39.6± 2 4 .3) μg/L(P<0 .0 5 ) ,而两者术前血清AFP浓度差异无显著性意义。结论 希罗达能有效抑制人肝癌组织AFPmRNA的表达 ,并降低其表达产物血清AFP浓度。

小鼠烫伤创面区域巨噬细胞集落刺激因子表达的变化

目的 通过应用逆转录多聚酶链式反应 (RT -PCR)及巢式多聚酶链式反应 (Nest-PCR)技术 ,研究创面区域巨噬细胞集落刺激因子 (M -CSF)mRNA的表达情况 ,探求创面区域M -CSF水平升高的来源。方法 清洁级无特异病原体C5 7BL/ 6小鼠 18只 ,随机分为烫伤组 (n =9)及假烫组 (n =9) ,烫伤组造成 2 0 %TBSAⅢ度烫伤。分别于烫伤后第 1、10天取创面区域组织及相应背部皮肤 ,抽提组织总RNA。RT -PCR及Nest -PCR产物经 2 %琼脂糖电泳 ,溴化乙锭染色、紫外灯下照相 ,密度分析软件分析密度。结果 在烫伤后第 1天创面组织中几乎检测不到M -CSFmRNA的表达 ,而在烫伤后第 10天创面组织中的M -CSFmRNA明显高于假烫组。结论 结合组织学检查结果 ,我们推测创面区域M -CSF表达的升高可能与创面局部的成纤维细胞、内皮细胞有关。

干细胞因子mRNA在原代白血病细胞的表达

目的 观察白血病原代细胞中干细胞因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ的表达情况并探讨其与预后的关系。方法 以巢式逆转录 多聚酶链反应检测了４９例（两种类型）白血病患者骨髓原代白血病细胞中ＳＣＦ ｍＲＮＡ的表达情况。结果 在１９例急性 淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）中，ＳＣＦ ｍＲＮＡ ５例阳性、１４例阴性；３０例急性髓性白血病（ＡＭＬ）中，２４例Ｍ１～Ｍ４亚型者表达 ＳＣＦ ｍＲＮＡ，４例Ｍ５及２例Ｍ６为阴性。两组间有显著差异（Ｐ<0.05）。在２９例ＳＣＦ阳性者中，８例（２７．６％）属难治性白 血病；在２０例ＳＣＦ阴性者中，１２例（６０．０％）为难治性白血病（Ｐ<０．０５）。结论 ＡＭＬ组的ＳＣＦ表达率显著高于ＡＬＬ；ＳＣＦ 阴性提示患者预后较差，其确切机制有待进一步研究。

宁夏地区牛脑组织博尔纳病病毒的感染状况

目的分析宁夏地区牛脑组织博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的感染状况,探讨阳性基因扩增片段与德国马源性标准病毒株He/80同源性。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)分别检测宁夏地区145例健康牛脑组织中BDVp40、BDVp24基因片段,对BDVp24阳性扩增产物进行基因序列测定,并应用BLAST和DNAsist 5.0软件对测序结果进行分析。结果 145例牛脑组织中4例BDVp40、BDVp24均阳性,阳性率为2.759%,且阳性BDVp24片段的核苷酸序列与He/80同源性最高,所编码氨基酸序列相同。结论宁夏地区牛脑组织中可能存在动物源性BDV的自然感染,阳性BDV p24核苷酸序列与He/80具有高度同源性,所编码的氨基酸序列相同。

CK20 mRNA在大肠癌患者外周血中阳性表达的临床意义

目的 :研究大肠癌患者外周血中 CK2 0 m RNA的阳性表达可作为肿瘤细胞血行播散的标志 ,探讨CK2 0 m RNA阳性表达与肿瘤病理指标的关系 ,观察大肠癌患者手术前、后外周血中 CK2 0 m RNA表达的变化情况。方法 :采用巢式逆转录多聚酶链反应 ( RT- PCR)的方法 ,对大肠癌 4 2例、原发性肝细胞肝癌 5例、对照组 (非癌肿 ) 10例患者手术前、后不同时间外周血中肿瘤细胞的靶基因 CK2 0 m RNA表达进行检测。结果 :对照组 (非癌肿 ) 10例及原发性肝细胞肝癌 5例手术前、后外周血中 CK2 0 m RNA均为阴性表达。大肠癌组 4 2例 ,手术前外周血中 CK2 0 m RNA阳性表达率为 5 0 .0 % ( 2 1/ 4 2 ) ,手术后 4 8h外周血中 CK2 0 m RNA阳性表达率为 5 9.5 % ( 2 5 / 4 2 )。大肠癌患者外周血中 CK2 0 m RNA的阳性表达率与肿瘤细胞病理分化程度无关 ,与 Dukes分期、淋巴结转移、远处转移有关。结论 :大肠癌患者外周血中 CK2 0 m RNA的阳性表达可作为肿瘤细胞血行播散的标志 ,有助于判断大肠癌的预后及鉴别原发性肝细胞肝癌和大肠癌肝转移。手术操作会促使肿瘤细胞向血液中播散 ,手术过程中应加强预防措施以减少癌细胞的播散。

Effects of Shenggu Injection (生骨注射液) on mRNA Expression of Vascular Endothelia Growth Factor in Rat Osteoblasts in vitro

Objective： To study the effects of Shenggu injection （生骨注射液,SGI） on mRNA expression of vascular endothelia growth factor （VEGF） in rat osteoblasts in vitro and to explore its possible molecular mechanisms in promoting fracture healing. Methods： Rat osteoblasts cultured in vitro were stimulated with SGI according to the protocol. The expression levels of VEGF mRNA in the cells in every group were examined by reverse-transcriptase ploymerase chain reaction （RT-POR）. Results： When osteoblasts were stimulated with different concentrations of SGI for 5 days, the expression of VEGF mRNA peaked with 1 mg/ml SGI on the 5th day. When treated with 1 mg/ml SGI from the 1st to the 5th day, the expression of VEGF mRNA increased gradually with the increase of culturing time. Conclusion： SGI could promote significantly the expression of VEGF mRNA in rat osteoblasts in vitro. The levels of expression of VEGF mRNA changed along with different concentrations and stimulating time of SGI.

CK20mRNA在大肠癌患者外周血中的表达及其临床意义

目的探讨大肠癌患者外周血中CK20mRNA的阳性表达可否作为肿瘤细胞血行播散的标志。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测34例大肠癌患者术前、术后外周血中细胞角蛋白(CK20mRNA)。结果对照组(非癌肿)20例及原发性肝细胞肝癌6例外周血中CK20mRNA均为阴性表达。大肠癌组34例,手术前外周血中CK20mRNA阳性表达率为64.17%,手术后72h外周血中CK20mRNA阳性表达率为67.65%。大肠癌患者外周血中CK20mRNA的阳性表达率与肿瘤细胞病理分化程度无关,与Dukes分期、淋巴结转移、远处转移有关。结论大肠癌患者外周血中CK20mRNA的阳性表达可作为肿瘤细胞血行播散的标志,有助于大肠癌预后的判断。手术操作会促使肿瘤细胞向血液中播散,手术过程中应加强预防措施以减少癌细胞的播散。

前列腺癌患者外周血DD3 mRNA的检测及临床意义

目的 探讨检测前列腺癌(PC)患者外周血DD3mRNA在诊断和治疗监测中的意义。方法 用巢式逆转录聚合酶链反应(nRT PCR)检测44例不同分期PC患者和30例良性前列腺增生(BPH)患者及18名健康男性志愿者外周血中DD3mRNA,并进行对比分析。结果 BPH患者和健康男性志愿者外周血中DD3mRNA均阴性;未治疗PC组外周血DD3mRNA100%阳性(11 /11),而经内分泌治疗PC组阳性率30. 3% ( 10 /33 ),两组差异有统计学意义(P<0. 01 )。结论 外周血DD3mRNA是PC诊断和内分泌治疗监测的良好指标,有望成为PC特异性肿瘤标志物。