EphB/Ephrin-B1信号对睫状神经节α3-nAChRs电流的影响

目的探讨EphB/Ephrin-B1信号对鸡胚睫状神经节(ciliary ganglion,CG)神经元上α3-尼古丁乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,α3-nAChRs)电流的影响。方法用膜片钳技术分别在培养的和急性分离的CG神经元上记录α3-nAChRs电流,细胞被随机分为:对照组;Ephrin-B1Fc治疗组——用Ephrin-B1与IgG重组后形成的Ephrin-B1Fc刺激细胞;IgG治疗组——用重组Ephrin-B1Fc所需相同浓度的IgG刺激细胞;Ephrin-B1治疗组——用重组Ephrin-B1Fc所需相同浓度的Ephrin-B1刺激细胞,观察电流的变化。结果对照组、IgG治疗组和Ephrin-B1治疗组之间α3-nAChRs电流无显著差异(P>0.05),而此3组与Ephrin-B1Fc治疗组之间有显著差异(均P<0.05),Ephrin-B1Fc可浓度依赖性抑制α3-nAChRs电流,该过程可快速发生并呈现可逆性。培养的和急性分离的CG神经元Ipeak/Cm的IC50分别为4.9μg/ml和8.4μg/ml。结论本研究表明Eph/Ephrin-B1信号可影响CG神经元α3-nAChRs的电流,提示Eph/Ephrin-B1可能参与交感神经系统功能的调控。

益肺宣肺降浊方对星形胶质细胞-神经元氧糖剥夺损伤的缓解作用及其可能机制

目的 分析益肺宣肺降浊方对星形胶质细胞-神经元氧糖剥夺(OGD)损伤的缓解作用,并基于胆碱乙酰转移酶(ChAT)、α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)及炎症因子探讨其可能的作用机制。方法 (1)制备对照血清及益肺宣肺降浊方含药血清。(2)分离培养新生大鼠海马星形胶质细胞和神经元。将细胞分为对照组、OGD组、OGD+YFXF组、OGD+YFXF+山莨菪碱组。在对照组中,常规培养原代海马神经元和星形胶质细胞;在OGD组、OGD+YFXF组、OGD+YFXF+山莨菪碱组中,建立星形胶质细胞-神经元OGD模型,并分别使用含5%对照血清的高糖DMEM、含5%益肺宣肺降浊方含药血清的高糖DMEM、含5%益肺宣肺降浊方含药血清及100μg/mL山莨菪碱的高糖DMEM进行培养。(3)干预24 h后,观察各组细胞形态,检测星形胶质细胞和神经元的标志物表达情况,星形胶质细胞活性氧簇含量、ChAT活性、α7-nAChR和ChAT的mRNA和蛋白表达量,以及上清液乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6水平。结果 与对照组相比,OGD组星形胶质细胞及神经元标志物荧光强度减弱,神经元形态异常,星形胶质细胞的活性氧簇含量及上清液LDH、IL-1β、TNFα、IL-6水平增加,星形胶质细胞的ChAT活性降低且α7-nAChR、ChAT的mRNA和蛋白表达量下调(P<0.05)。与OGD组相比,OGD+YFXF组星形胶质细胞及神经元标志物荧光强度增强,神经元形态有所改善,星形胶质细胞的活性氧簇含量及上清液LDH、IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低,星形胶质细胞的ChAT活性增强且α7-nAChR、ChAT的mRNA和蛋白表达量上调(P<0.05)。与OGD+YFXF组相比,OGD+YFXF+山莨菪碱组的星形胶质细胞和神经元的标志物荧光强度减弱,神经元形态异常,星形胶质细胞的活性氧簇含量及上清液LDH、TNF-α水平增加,星形胶质细胞的α7-nAChR mRNA和蛋白表达量降低(P<0.05)。结论 益肺宣肺降浊方可能通过上调海马星形胶质细胞中α7-nAChR的表达、增强ChAT活性、抑制炎症反应,来缓解星形胶质细胞-神经元OGD损伤,这或许是该方改善缺血再灌注损伤介导的血管性痴呆的作用机制。

侧脑室注射烟碱对小鼠异氟烷、七氟烷亚麻醉下遗忘作用的影响

目的探讨神经元烟碱受体(neuronal nicotinic acetyl-choline receptor,nnArchR)与吸入麻醉药异氟烷、七氟烷遗忘作用的关系。方法建立小鼠腹腔注射异氟烷、七氟烷遗忘模型,在跳台、避暗实验中观察不同剂量烟碱(nicotine,N)侧脑室注射(intracerebroventricular,icv)对跳台潜伏期(stepdownlatency,SDL)、步入潜伏期(step through latency,STL)、错误次数(error times)的影响。结果侧脑室注射烟碱可延长异氟烷、七氟烷所致记忆障碍小鼠的SDL、STL,减少错误次数。结论神经元烟碱受体是异氟烷、七氟烷遗忘作用的重要靶位,侧脑室注射烟碱具部分改善小鼠异氟烷、七氟烷遗忘作用。

乙酰胆碱受体抗体与大鼠中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体之间免疫结合反应

本研究旨在探讨长期以来无定论的重症肌无力（MG）患者血和脑脊液（CSF）中的乙酰胆碱受体抗体（AChRab）能否与中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体（神经-nAChR）结合，并引起中枢神经系统（CNS）功能障碍。用免疫亲和层析法从AChRab阳性的全身型MG患者血中提取纯化AChRab，然后用免疫组化法探讨AChRab与大鼠中枢神经-nAChR之间的免疫结合反应。结果首次表明，AChRab与神经-nAChR之间的阳性免疫结合反应广泛分布于大鼠大脑皮层、脑干颅神经运动核团、脊髓前角运动神经元等部位，提示MG患者AChRab不仅可与神经肌接头（NMJ）处肌-nAChR结合引起肌无力等症状，还可与CNS神经-nAChR结合，并可能引起CNS功能障碍。

重症肌无力AChRAb与培养神经元nAChR免疫结合反应研究

目的 从离体细胞水平对重症肌无力 ( MG)患者伴有中枢神经系统 ( CNS)受损的机制进行探讨。方法 从 MG患者和正常人血中提取 Ig G。体外培养新生 SD大鼠皮层、脑干、海马神经元 ,同时培养 TE-6 71细胞株作阳性对照 ,然后其与神经元特异性抗体及胆碱能神经元特异性抗体进行间接免疫荧光双标记 ,观察其免疫结合反应。结果 MG患者 Ig G可与离体培养的皮层、脑干、海马神经元及 TE6 71免疫结合 ,而正常人血中提取的Ig G则否。结论 MG患者外周 Ig G( ACh RAb)可与离体培养的神经 -烟碱型乙酰胆碱受体 ( n ACh R)结合 ,是MG患者 CNS受损的可能机制。

侧脑室注射烟碱拮抗恩氟烷的催眠、遗忘作用

目的探讨神经元烟碱受体(neuronal nicotinic acetyl-choline receptor,nnAchR)与吸入麻醉药恩氟烷催眠、遗忘作用的关系。方法小鼠腹腔注射不同剂量的恩氟烷(2.2,0.4ml.kg-1)建立模型,催醒实验中观察不同剂量的烟碱(nicotine,N)侧脑室注射(intracerebroventricular,icv)对小鼠睡眠时间(sleeping time,ST)的影响;跳台、避暗实验中观察不同剂量的烟碱icv对跳台潜伏期(step down latency,SDL)、步入潜伏期(step through latency,STL)和错误次数的影响。自主活动实验观察恩氟烷(0.4ml.kg-1)对小鼠自主活动次数的影响。结果和对照组相比,脑室注射烟碱能缩短恩氟烷麻醉小鼠的ST,延长恩氟烷所致记忆障碍小鼠的SDL、STL,减少错误次数。0.4ml.kg-1腹腔注射对小鼠自主活动无明显影响。结论本实验结果提示脑内的神经元烟碱受体是恩氟烷催眠、遗忘作用的重要靶位之一。

活忆饮对阿尔茨海默病模型大鼠β-淀粉样肽1-40和烟碱型胆碱受体的影响

目的:观察中药方剂活忆饮对实验性阿尔茨海默病(AD)模型大鼠脑内不同部位β-淀粉样肽1-40(Aβ1-40)和烟碱型胆碱受体(nAchR)表达的影响,探讨中医药治疗AD的方法。方法:成年健康雌性Wistar大鼠15只,在脑立体定位仪上切断大鼠双侧穹窿-海马伞,切除双侧卵巢,建立实验性AD动物模型。按随机数字表法分为3组,每组5只。1AD组:4.8 ml生理盐水灌胃,每日1次;2雌激素治疗组(E2组):苯甲酸雌二醇(1 mg/kg)皮下注射,每周1次;3活忆饮治疗组:中药方剂活忆饮每次灌胃4.8 ml,每日1次(活忆饮主要由补肾益精中药熟地,活血行气中药黄芪,以及泻火解毒中药黄连等组成,水煎浓缩至含生药量1 kg/L汤剂)。所有大鼠均治疗28 d。采用免疫组化染色观察大脑皮质区、海马CA1区、杏仁复合体区、Meynert核区的Aβ1-40、nAchR阳性细胞表达。结果:活忆饮治疗组和E2组皮质区、海马CA1区、杏仁复合体区、Meynert核区nAchR阳性细胞数均显著高于AD组,而Aβ1-40阳性细胞数显著低于AD组(P<0.05或P<0.01)。活忆饮治疗组大脑皮质区、杏仁复合体区nAchR阳性细胞数较E2组均明显升高,海马CA1区和Meynert核区Aβ1-40阳性细胞数则均较E2组显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:中药方剂活忆饮可以提高AD模型大鼠脑内不同部位nAchR表达,降低Aβ1-40表达,具有干预AD病理过程的作用。

神经元烟碱受体在全身麻醉机制中的作用

作为配体 门控离子通道超家族成员的神经元烟碱受体分布于中枢和外周神经系统 ,包括多种亚型 ,具有广泛的生理作用 ,可以成为多种疾病的药物治疗靶点。它在全身麻醉原理中的作用也被日益重视 ,部分全身麻醉药物 (挥发性吸入、气体吸入麻醉药、硫喷妥钠、氯胺酮等 )在低于临床麻醉剂量时能够明显抑制该受体功能 ,神经元烟碱受体可能参与了这些药物的临床作用机制。

3T3-L1前脂肪细胞中烟碱样乙酰胆碱受体α7对脂肪因子肾上腺髓质素mRNA表达的影响

目的研究3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中是否有胆碱能系统物质mRNA的表达,及烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)α7功能状态对脂肪因子肾上腺髓质素(AM)mRNA表达的影响,初步阐明脂肪细胞中非神经胆碱能系统与肥胖、胰岛素抵抗及其他脂代谢性疾病的关系。方法以3T3-L1前脂肪细胞和诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中是否有乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和nAChR α7三种胆碱能系统主要组分的mRNA表达;对前脂肪细胞及成熟脂肪细胞分别予不同水平的广谱nAChR激动剂尼古丁、特异性nAChR α7激动剂氯化胆碱及特异性nAChRα7拮抗剂甲基牛扁亭碱处理12、24、36h,并设立相应处理时间的空白对照组,应用RT-PCR方法检测前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA的表达。结果1.RT-PCR方法证实在3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中均有AChE、ChAT、AChR α7的mRNA表达。2.给予不同剂量的尼古丁和氯化胆碱,干预作用不同时间,3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA表达水平与相应的空白对照组比较均呈剂量依赖性升高(P<0.05或P<0.01),但随干预作用时间延长,这种剂量依赖性上调效应减弱。二种激动剂以氯化胆碱的剂量依赖性上调效应更明显。而相同剂量下不同作用时间的处理组间无统计学差异(Pa>0.05)。3.拮抗剂甲基牛扁亭碱对3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA表达则呈明显的剂量依赖性抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中存在非神经元型胆碱能系统,其中nAChR α7调节脂肪因子AM mRNA的表达,脂肪组织中非神经元型胆碱能系统的重要组分nAChR α7可能在肥胖、胰岛素抵抗及其他脂代谢相关疾病的病理生理过程中发挥重要作用。

神经元烟碱受体介导的钙信号及其调节作用

神经元烟碱受体广泛地分布于中枢神经系统并参与脑内信号传导系统的调节过程。烟碱受体对钙离子通透的特点在其中发挥了重要的作用。这种激活烟碱受体产生的由钙离子介导的复杂的信息传递或许与学习记忆的提高、药物成瘾或神经保护机制有密切的关系。

江西产银环蛇毒中K-神经毒素的分离纯化

利用 3次阳离子层析法从江西产银环蛇毒中分离得到 2个相对分子质量均为 6 50 0的K -神经毒素 进一步证实了K -神经毒素是银环蛇毒的基本成分 K -神经毒素是目前唯一的可用于烟碱受体分型的工具 它可高效地识别α3β2

灯盏细辛活性部位对神经细胞α7尼古丁受体表达的影响

目的:研究灯盏细辛活性部位对SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体(nAChR)亚单位在蛋白质水平的表达以及对抗β-淀粉样蛋白的毒性作用。方法:灯盏细辛经乙醇提取、乙酸乙酯及正丁醇萃取、再以反相硅胶柱分离等方式得到极性部位,选取一定浓度的灯盏细辛提取物处理神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后,用Western blotting方法测定α7 nAChR蛋白水平的变化;再将能明显上调α7 nAChR蛋白水平的灯盏细辛提取物预处理SH-SY5Y细胞后,加入Aβ25-35处理,用比色法测定MTT还原率,观察灯盏细辛活性部位对细胞毒性的影响。结果:灯盏细辛醇提乙酸乙酯及正丁醇部位、以及该部位经反相硅胶柱分离的低极性部位均能显著上调α7 nAChR蛋白水平,并减弱β-淀粉样蛋白引起的细胞损伤。结论:灯盏细辛活性部位具有一定的神经保护作用,其机制之一可能与上调α7 nAChR有关。

MG患者AChRAb对培养大鼠神经元胞浆钙的影响

目的 本研究从离体细胞水平探讨重症肌无力 (MG)患者 CNS受损的可能机制。方法 从 MG患者和正常人血中提取 Ig G。体外培养新生 SD大鼠皮层神经元 ,用免疫组化法观察 ACh RAb与神经元 n ACh R免疫结合反应 ,并行神经元胞浆钙测定。结果 MG患者 Ig G可与离体培养的皮层神经元免疫结合并引起异常胞浆钙变化 ,而正常人血中提取的 Ig G则否。结论 MG患者外周 Ig G(ACh RAb)可与离体培养的神经元 n ACh R结合并引起神经元生理活性变化 ,是 MG患者 CNS受损的可能机制。

α3神经型尼古丁乙酰胆碱能受体在阿尔茨海默病中的抗炎作用

目的探讨α3nAChRs在阿尔茨海默病(AD)中的抗炎作用。方法应用Western印迹,ELISA及实时定量PCR检测各组细胞核因子(NF-κBp65)和炎性趋化因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1),巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的蛋白及mRNA表达情况。结果与对照组比较,淀粉样蛋白(Aβ)处理α3nAChR siRNA SH-SY5Y细胞NF-κBp65、TNF-α蛋白及mRNA表达增加(P<0.05);MCP-1、MIP-1α表达变化不明显。结论 Aβ引起SH-SY5Yα3nAChR siRNA细胞NF-κBp65、TNF-α蛋白及mRNA表达升高,α3nAChR可能具有一定抗炎作用。

麻醉药作用机制及其保护作用与离子通道相关性研究进展

麻醉药广泛应用于临床各类手术中,但其麻醉作用机制至今仍不清楚。随着更多新技术的应用,发现麻醉药的作用机制主要与增强GABAA-R通道,抑制N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate acid,NMDA)和神经元烟碱乙酰胆碱受体通道的功能以及抑制电压门控离子通道开放等有关。同时麻醉药的脏器保护作用也与离子通道有关,主要通过激活K+通道,抑制Ca2+内流等途径实现。本文将从这两方面综述麻醉药与离子通道的关系。

激活α7烟碱型乙酰胆碱受体减轻大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤

目的研究激活α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n AchR)对大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤的作用及可能机制。方法取体外培养7 d的原代大脑皮质神经元,随机分为3组:对照组、氧糖剥夺组、PNU-282987(α7n AchR激动剂)组。氧糖剥夺组细胞氧糖剥夺12 h;PNU-282987组用PNU-282987预处理细胞24 h,然后氧糖剥夺12 h。采用CCK-8测定3组大脑皮质神经元存活率,比色法检测上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenate,LDH)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率和活性氧(reactive oxygen species,ROS)产量,蛋白质印迹法检测血红素氧化酶(hemeoxygenase-1,HO-1)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达量。结果与氧糖剥夺组相比,PNU-282987可提高大脑皮质神经元存活率(P<0.05),降低LDH含量(P<0.05),抑制细胞凋亡(P<0.05),降低ROS产量(P<0.05),同时使HO-1蛋白表达升高、HIF-1α蛋白表达减少(P<0.05)。结论激活α7n AchR具有抗大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤作用,该作用可能与抗氧化应激有关。

α-芋螺毒素特异性结合受体-神经型烟碱乙酰胆碱受体的同源模建及功能预测

目的探讨神经型烟碱乙酰胆碱受体能被其竞争性拮抗剂α-芋螺毒素选择性阻断的机理。方法采用同源模建的方法构建神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型的三维空间结构,并利用分子对接的方法与已知空间构像的α-芋螺毒素对接。结果已构建的神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型结构合理,并与已知空间构像的α-芋螺毒素对接成功。结论传统的烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂缺乏专一性,而靶向神经元神经型烟碱乙酰胆碱受体的α-芋螺毒素种类多,特异性强,与不同亚单位组成的受体亲和力不同,应用潜力很大。

Orexin-A对脊髓腹角神经元基本电生理参数及尼古丁电流的作用

目的:研究orexin-A对脊髓腹角神经元基本电生理参数及烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的作用。方法:使用7~12d的新生SD大鼠。麻醉后,将含有腰骶膨大的脊髓分离并切片。用木瓜蛋白酶(papain,0.18g/30mL人工脑脊液消化切片并孵育40min。显微镜下选取腹角,使用抛光的巴斯德吸管进行神经元的急性机械分离。对贴壁的健康神经元进行穿孔膜片钳记录。结果:①急性分离的脊髓腹角神经元状态良好,具有形状多样的胞体和完整的突起;②9个急性分离的脊髓腹角神经元有自发动作电位;③持续灌流orexin-A(OXA)2min后,在5例细胞记录到4个脊髓腹角神经元的自发动作电位放电频率增加了(63.64±5.25)%,幅度等参数无明显变化;④在15个神经元,有12例细胞给予0.3mmol/L尼古丁诱导出内向电流,幅度为(142.97±75.02)pA,用100nmol/LOXA进行2min的预处理,可显著抑制电流幅度至(69.07±61.07)pA(P<0.001),抑制率为(54.75±22.62)%;⑤在9个神经元中有7例细胞给予尼古丁诱导的电流幅度为(129.31±69.38)pA,将100nmol/LOXA共同施用于神经元,尼古丁诱导的电流幅度降为(68.61±34.98)pA,在此基础上,通过施用orexin-1受体(OX1R)拮抗剂SB334867(10μmol/L)2min后可阻断OXA对尼古丁诱导电流的抑制作用,电流幅值为(93.46±56.45)pA。因此,SB334867可完全取消OXA对尼古丁电流的抑制作用。但对于另两例神经元,SB334867并未阻断OXA的抑制作用。结论:Orexin-A可能通过OX1R对脊髓大部分腹角神经元的尼古丁电流具有抑制作用,但不能排除orexin-2受体(OX2R)也参与OXA作用的可能性。

α7-nAChR正向变构调节剂对原代海马神经元活性影响

目的探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的正向变构调节剂(PAM)NS1738(Ⅰ型PAM)和PNU120596(Ⅱ型PAM)对原代培养的海马神经元活性的影响。方法原代培养的海马神经元用胆碱(choline)、choline+NS1738、choline+PNU120596处理7 d后,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH的分泌情况,流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψm)的变化。结果与对照组(不做任何处理)相比,choline+NS1738组和choline+PNU120596组原代海马神经元Bax/Bcl-2蛋白表达比值显著降低(F=12.15,q=7.742、6.982,P<0.05),LDH分泌明显减少(F=11.72,q=6.551、7.807,P<0.05),△Ψm明显升高(F=21.73,q=7.835、4.331,P<0.05)。与choline组相比较,choline+NS1738组和choline+PNU120596组原代海马神经元Bax/Bcl-2蛋白表达比值和LDH分泌差异无显著性(P>0.05);而△Ψm明显升高,差异具有统计学意义(F=21.73,q=10.550、7.045,P<0.05)。结论α7-nAChR PAM能够减少原代培养海马神经元的凋亡数量,升高细胞活性。

针刺对失眠大鼠自发活动节律周期及丘脑网状核内γ-氨基丁酸能神经元的影响

目的:观察针刺对失眠大鼠自发活动近日节律周期、丘脑网状核(TRN)内γ-氨基丁酸(GABA)能神经元、神经元上α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChRs)和神经元突触可塑性的影响,探讨针刺治疗失眠的中枢调节机制。方法:将24只SPF级雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组,每组8只,采用对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射法建立失眠大鼠模型。针刺组于每日ZT授时因子时间(ZT4)(11:00)针刺单侧内关、足三里,每日1次,每次15 min,每5分钟行平补平泻的捻转手法1 min,共5 d。观察大鼠24 h自发活动昼夜节律周期及TRN内小清蛋白阳性神经元(PV)/α7-nAChRs、PV/突触后致密蛋白-95(PSD-95)的共表达情况。结果:造模后,模型组及针刺组自发活动近日节律周期显著缩短(P<0.01,P<0.05);针刺治疗后,针刺组自发活动近日节律周期延长,恢复至正常状态(P<0.05)。免疫荧光结果显示,模型组TRN内PV/α7-nAChRs、PV/PSD-95共表达水平均显著降低(P<0.01,P<0.05);针刺组TRN内PV/α7-nAChRs、PV/PSD-95的共表达水平均显著增加(P<0.05)。结论:针刺可能通过上调PV阳性神经元上α7-nAChRs的表达,激活TRN内GABA能神经元并改善神经元突触可塑性,恢复失眠大鼠自发活动近日节律周期,从而发挥治疗失眠的作用。