猕猴桃AcNCED的克隆与表达分析

【目的】9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是类胡萝卜素降解酶,同时是脱落酸(ABA)合成的关键酶。为探明AcNCED基因家族各成员在猕猴桃果实发育期的表达特性。【方法】利用RT-PCR技术从猕猴桃中分离4个NCED基因,分别命名为AcNCED1-4,并用qRT-PCR技术分析它们在猕猴桃不同组织和果实发育期的表达。【结果】AcNCED1、AcNCED2、AcNCED3和AcNCED4的开放阅读框(ORF)分别为1 755、1 830、1 797和1 788 bp,它们分别编码585、610、599和596个氨基酸。经预测,AcNCED1、AcNCED3和AcNCED4蛋白定位于叶绿体,AcNCED2蛋白定位于细胞质,均无信号肽,属于非分泌蛋白。qRT-PCR分析表明,AcNCEDs在茎中表达量最高,根中最低,在果实发育前期及成熟期高表达。【结论】4个基因编码的蛋白都较为保守且表达量均具有组织特异性,为进一步探明AcNCED的生物学功能奠定基础。

枸杞脱落酸生物合成关键酶基因NCED的克隆及表达分析

脱落酸(abscisic acid,ABA)对植物的生长发育具有独特的调控功能,并在植物适应逆境环境中发挥重要作用。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是高等植物中ABA生物合成途径的一个关键酶。根据GenBank中的植物NCED基因的同源序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE技术从枸杞叶片中克隆到1个编码NCED的基因,命名为LbNCED。其cDNA全长为2316 bp,含有1个1824 bp的开放阅读框,编码1个含607氨基酸残基,分子量为67.38 kDa、等电点(pI)为6.43的假定蛋白,其氨基酸序列与番茄(Lycopersicon esculentum)和马铃薯(Solanum tuberosum)的同源性达90%,在N-末端具有1个含15个氨基酸的叶绿体转运肽。Southern杂交结果表明,该基因在枸杞基因组中以低拷贝形式存在。盐处理和脱水处理的枸杞叶片中LbNCED基因的表达与内源ABA的积累同步变化。

无核荔枝ABA生物合成关键酶LcNCED基因克隆及其在生理落果阶段中的表达分析

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoids dioxygenase,NCED)是ABA生物合成途径的关键限速酶,本研究利用RT-PCR技术从A4无核荔枝中分离得到NCED的3条c DNA序列(命名为LcNCED1、LcNCED2和LcNCED3)。通过同源比对和系统进化树分析,LcNCED基因编码的氨基酸序列与拟南芥等30个物种中的NCED氨基酸序列同源性都在65%以上,从而确定LcNCED属于NCED家族;通过与7条拟南芥及5条苹果NCED家族基因进行系统进化树分析,LcNCED2与调控苹果花瓣脱落MdNCED2、MdNCED4基因具有较高的同源性。Real-Time PCR表达分析发现,3个LcNCED基因在不同样品间表达存在显著差异,其中LcNCED2在各样品间的表达水平显著高于LcNCED1和LcNCED3,且LcNCED2表现出显著的组织特异性表达特点,花后15~75 d,LcNCED2在离区(果柄离层部位上下0.2 cm)中的表达量均高于种脐和果皮中,在花后45 d达到峰值,花后75 d稍有下降,基因表达的峰值略早于A4无核荔枝落果高峰期。而LcNCED1和LcNCED3在各组织样品中基因表达变化趋势规律不明显。上述结果表明,LcNCED2在离区中表达量变化比较符合A4无核荔枝生理落果趋势,推断LcNCED2基因可能与无核荔枝采前落果关系密切。

拟南芥干旱诱导型启动子RD29A驱动花生AhNCED1基因双元表达载体的构建

从拟南芥基因组中克隆RD29A基因5'-侧翼520bp启动子区域序列,生物信息学分析表明,该启动子片段中存在脱水胁迫响应元件(DRE)、ABA响应元件(ABRE)、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。构建了干旱诱导型启动子AtRD29Ap驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1。

番茄LeNCED1基因5′-侧翼序列克隆及LeNCED1p:GUS融合基因构建

从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5′-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件Box I、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS。

叶子花脱落酸生物合成关键酶基因NCED的克隆及调节开花功能初探

以叶子花品种‘大红宝巾’(Bougainvillea glabra‘Mrs Butt’)的2年生扦插苗为试验材料,克隆到了一个9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)同源基因,并分析了内源脱落酸(ABA)含量及NCED活性等变化与该基因表达之间的内在联系,探讨ABA对促进叶子花开花的作用机理。结果表明:(1)外源50mg·L-1 ABA处理促进了叶子花开花,而与10μmol·L-1的去甲二氢愈创木酸(NDGA,ABA合成抑制剂)共处理可抑制这种效果。(2)外源ABA处理可诱导叶子花叶片中内源ABA含量和NCED含量与活性上升,这种诱导可被NDGA抑制。(3)克隆得到的NCED基因全长为2 380bp,其推定的编码蛋白包含618个氨基酸残基,与草莓中的FvNCED1同源性最高,命名为BgNCED1。(4)Real-time PCR结果显示,外源ABA处理显著诱导BgNCED1基因的表达,而10μmol·L-1的NDGA可显著抑制BgNCED1基因的诱导效果,这种表达模式与内源ABA含量及NCED活性等的变化趋势较为一致。研究认为,外源ABA可能通过诱导BgNCED1的表达,增强内源ABA的生物合成,进而促进叶子花从营养生长到生殖生长的转变,使其提前开花。

白花泡桐NCED基因家族分析及其对丛枝植原体的响应

【目的】研究NCED家族基因在泡桐丛枝病发生过程中的作用。【方法】基于白花泡桐(Paulownia fortune)基因组图谱,采用生物信息学方法对白花泡桐NCED(PfNCED)家族进行成员鉴定,系统进化、基因结构和启动子顺式作用元件进行分析,并结合转录组、实时定量PCR和互作蛋白预测等方法筛选与丛枝病发生相关基因。【结果】发现PfNCED家族共有28个基因,分布在8条染色体上;进化树分析结果表明该家族基因可以分为4组,与拟南芥的同源性较高;共线性分析发现该家族发生5次片段复制事件;顺式作用元件表明PfNCED可能响应植物激素处理和环境胁迫。结合丛枝病发生前后的转录组分析,发现7个差异PfNCED可能与泡桐丛枝病发生相关;进一步的蛋白互作网络分析发现PfNCED16可能在丛枝病腋芽形成中发挥重要作用。【结论】白花泡桐中有28个PfNCED基因,其中PfNCED16可能在白花泡桐丛枝形成过程中发挥重要作用。

西瓜NCED基因的鉴定及其对枯萎病和脱落酸的表达模式分析

脱落酸(abscisic acid,ABA)是植物生长发育和逆境胁迫所必需的一种重要的植物激素,而9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是催化植物ABA合成的关键限速酶,在植物对干旱、高盐及病原菌等逆境的响应过程中发挥十分重要的作用。然而,目前还没有报道对西瓜中的ClNCED基因进行分离和鉴定。本研究在西瓜基因组中利用生物信息学技术共鉴定出10条ClNCED基因,预测并分析了这10条ClNCED基因的基因结构、染色体位置、亚细胞定位等基本信息及在西瓜不同组织器官、ABA和枯萎病处理下的表达模式。亚细胞定位预测发现大部分西瓜ClNCED蛋白主要被定位在叶绿体和细胞质中。利用不同物种的NCED蛋白进行进化分析发现西瓜ClNCED蛋白聚类在5个亚族中。亚族Ⅳ是西瓜特异亚族,只包含一对串联重复基因ClNCED09和ClNCED10编码的蛋白。在所有西瓜ClNCED基因中,只有一半有内含子,内含子数由5~12不等。另外,我们还利用荧光定量PCR(RT-qPCR)对ClNCED基因的时空表达模式进行分析,发现一半的西瓜ClNCED基因为特异表达基因,并且大部分在雄花中优势表达。此外,我们从ClNCED基因的启动子中发现了许多重要的顺式作用元件,这些元件与激素和逆境相关,对西瓜ClNCED基因在喷施ABA及接种尖孢镰刀杆菌后的表达水平进行分析,发现绝大部分ClNCED基因能响应ABA处理,同时还鉴定到多个响应枯萎病的ClNCED基因,这也为今后西瓜ClNCED基因的功能鉴定及相关的抗病分子育种提供重要的理论依据。