Nisin抗性菌株的筛选及其抗性基因的克隆

利用乳酸链球菌肽(Nisin)抗性基因常与乳糖利用基因位于同一质粒上这一特性,在含300IU/mL Nisin和质量浓度为0.004g/100mL溴甲酚紫的选择性培养基上,从新鲜牛奶中初筛到5株Nisin抗性菌株。经脱脂乳培养基培养、革兰氏染色和镜检,初步确定为乳球菌。分别以5株抗性菌株的基因组和质粒DNA为模板,采用PCR对其Nisin抗性基因(NSR)保守序列进行了扩增,从其中3株抗性菌株(分别命名为N1、N2、N3)的质粒DNA上得到大小约400bp的目的基因产物。经16S rDNA鉴定,进一步确定3株抗性菌株均为乳酸乳球菌。分别以N1、N2、N3的质粒为模板,采用PCR扩增其全长NSR基因,均得到大小约1000bp的目的产物。将从N1得到的NSR基因全长产物与pMD-19T进行连接测序,结果显示,其与已发表序列的相似性达99%,可确定其为NSR基因,且位于抗性菌株N1的质粒上。

乳酸乳球菌nisin抗性基因的克隆及作为筛选标记的研究

在添加500 U/mL nisin和溴甲酚紫的GM17选择性培养基上,分离到5株nisin抗性菌株。根据形态观察,生理生化特性和16S rDNA基因序列比对被鉴定为乳酸乳球菌。根据已报道nisin抗性基因设计引物,分别以这5株菌的染色体和质粒DNA为模板进行PCR扩增,结果从1株抗性菌株的染色体上得到目的基因产物。通过序列测定和同源性比对,证明为nisin抗性基因(nsr)。将nsr基因克隆到乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pTRKH2上,重组质粒命名为pT-nsr。pT-nsr电转化乳酸乳球菌MG1614,获得的重组菌MG1614/pT-nsr在含有500 U/mL nisin的培养基中生长情况良好。这表明nsr基因赋予宿主菌抗nisin特性,并且与红霉素抗性功能相同,因此nsr基因可以作为筛选标记用于食品级载体的构建。

乳酸乳球菌Nisin抗性基因的异源性表达和活性研究

目的评估乳酸乳球菌Nisin抗性基因在德氏乳杆菌保加利亚亚种的表达活性,为建立食品级筛选标记做准备。方法将新鲜牛奶接种于含有400μg/ml乳酸链球菌素的M17平板上,在分离的菌株中筛选乳酸乳球菌,同时提取其基因组DNA和质粒DNA,根据已公布的Nisin抗性基因序列设计一对引物,以提取的基因组DNA和质粒DNA为模板进行PCR扩增,产物进行电泳分析。将目的基因插入到大肠杆菌乳杆菌穿梭质粒—pMG36e中,并在德式乳杆菌保加利亚亚种中观察目的基因的表达活性及其作为筛选标记的活性。结果成功筛选出对Nisin具有抗性的乳酸乳球菌,进行目的基因扩增后成功将目的基因转化到L6032中,并表达出Nisin抗性。结论在德式乳杆菌保加利亚亚种中成功克隆及表达出Nisin抗性基因。

乳链菌肽(nisin)抗性机制的研究进展

乳链菌肽（nisin）是某些乳酸乳球菌产生的一种羊毛硫细菌素。其对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用,是目前世界上唯一被允许用作食品添加剂的细菌素。nisin的广泛使用虽未引发大范围的抗性,但在自然界或实验室的选择压力下,某些非nisin产生菌也获得了抵御nisin攻击的抗性机制。nisin抗性机制通常涉及两种方式,即非特异性的生理适应机制和特异性蛋白酶介导的主动防御机制。本文综述了近年来nisin抗性机制的研究进展。

大肠杆菌重组乳链菌肽抗性蛋白(NSR)的表达纯化及其功能分析

乳链菌肽(Nisin)是由某些乳酸菌产生的一种阳离子抗菌肽,而Nisin抗性蛋白(Nisin resistance protein,NSR)的表达则使一些非Nisin产生菌获得Nisin抗性。为深入探索NSR的作用机制,本研究在大肠杆菌中表达了去除N末端38个氨基酸残基的NSR(NSRΔ38)与GST的融合蛋白GST-NSRΔ38。通过谷胱甘肽(GSH)亲和层析和GST标签的切除后,得到纯化的NSRΔ38,并测定了该蛋白可能的nisin降解活性。反应产物的抑菌活性测定结果表明被NSRΔ38作用后的Nisin丧失了抑菌活性,而反相高效液相层析(RP-HPLC)分析结果进一步表明这是由NSRΔ38具备Nisin降解活性所造成的。本研究为NSR功能的深入研究奠定了工作基础。