内蒙古绒山羊毛囊不同发育时期BMP2、Noggin及SHH基因在皮肤中的表达

采用功能分类基因芯片方法,分析内蒙古绒山羊皮肤毛囊发育兴盛期和休止期BMP2、Noggin及SHH基因在皮肤中的表达,探讨其对毛囊发育的作用方式。结果表明:与兴盛期相比,休止期BMP2、Noggin及SHH基因表达分别上调24.61倍、下调0.16倍、下调0.22倍。BMP基因可抑制毛囊发育,且与维持毛囊处于休止期有关;在毛囊发育兴盛期,Noggin基因起强抑制BMP2基因表达的作用;在毛囊发育过程中,Noggin对BMP2基因的抑制作用至少是部分通过SHH实现的。

小鼠 noggin 基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10^(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。

Noggin mRNA与BMP4 mRNA在不同发育年龄大鼠海马与大脑皮层的表达

目的 观察不同发育年龄大鼠前皮质与海马内nogginmRNA与BMP4mRNA表达的变化特点。方法 应用RT PCR技术进行半定量分析。结果 在大鼠前皮质 ,nogginmRNA的表达在P1W明显降低 ,BMP4mRNA在P1M、P3M呈高表达。而在大鼠海马 ,nogginmRNA的表达在胚胎期 (E13、E16)表达最高 ,随着发育的进行逐渐降低 ;BMP4在不同发育阶段大鼠海马内的表达模式和noggin相反 ,即在胚胎期及新生期呈弱阳性表达 ,生后 1周表达开始升高 ,生后 2周明显升高 ,并维持这一较高水平 ,在生后 18月大鼠仍维持较高的水平。结论 NogginmRNA与BMP4mRNA在不同发育年龄大鼠的海马与前皮质均有表达 ,表达水平与发育年龄密切相关。Noggin基因与BMP4基因与海马及皮层的发育密切相关。

Noggin诱导泌乳素腺瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨骨形态生成蛋白4(BMP-4)拮抗剂Noggin诱导人泌乳素(PRL)腺瘤细胞的凋亡作用。方法:用MTT法和流式细胞仪检测研究Noggin诱导细胞凋亡的情况;用免疫组化和RT-PCR检测分析Noggin诱导细胞凋亡后对BMP-4蛋白和BMP-4mRNA的影响。结果:MTT法测定Noggin对PRL腺瘤细胞的IC50值为11μg/mL,不同浓度的Noggin对PRL腺瘤细胞具有抑制作用,并呈现剂量-效应关系。Noggin处理PRL腺瘤细胞后,AnnexinV标记的凋亡细胞增多,电镜观察细胞凋亡增多,同时Noggin可使BMP-4mRNA及BMP-4蛋白表达下降。结论:Noggin能诱导PRL腺瘤细胞发生凋亡,可有抗PRL腺瘤的作用。

转染Noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

目的构建Noggin基因的表达载体,分离骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转染Noggin基因的BMSCs在体外分化为神经元样细胞的情况。方法应用RT-PCR技术扩增Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2+〔Tα1〕-Noggin,分离、培养大鼠BMSCs,借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs。观察诱导后细胞形态变化,利用免疫细胞化学方法鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。利用RT-PCR方法检测神经细胞标记物mRNA的表达。结果成功构建Noggin基因的真核表达载体并分离培养BMSCs。转染Noggin基因表达载体后,分化的BMSCs形态似神经细胞;免疫化学检测到NSE、MAP-2特异性标志物表达,未检测到GFAP表达;RT-PCR测得神经细胞标记物GAP43、NCAM、SYN1表达。结论从形态、蛋白、基因水平证实转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为具有部分功能的神经细胞。

noggin基因修饰神经干细胞移植对衰老小鼠学习记忆能力的改善

本研究旨在探讨重组腺病毒介导的noggin基因修饰的小鼠神经干细胞(NSCs)移植入D-半乳糖致衰小鼠海马后的迁移及对小鼠学习记忆能力的影响。分别以含noggin基因的重组腺病毒(pAdEasy-1-noggin-GFP)及对照病毒(pAdEasy-1-GFP)转染体外培养的NSCs,获取神经干细胞克隆(NSCs-noggin;NSCs-GFP),移植入由D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠右侧海马CA3区,术后4周采用Y-电迷宫检测小鼠的学习记忆行为,并对各组小鼠脑组织海马段行石蜡冠状切片、免疫组织化学和BrdU免疫荧光化学方法检测。结果显示:基因修饰的NSCs移植对小鼠的学习记忆行为的改善比pAdEasy-1-GFP组更为明显,其记忆保持率持续时间更长;NSCs移植后能在宿主海马内迁移,基因修饰的NSCs移植组在海马内的BrdU阳性细胞数较多(P<0.05)。以上结果表明noggin基因不但可能参与衰老小鼠的学习记忆行为,而且能够促进NSCs的迁移。

绵羊Noggin基因的克隆、序列分析与原核表达

根据同源序列克隆原理设计一对引物,以绵羊脑组织总RNA的反转录产物为模板,利用RT-PCR扩增绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,克隆到pMD-18T载体。测序验证后,提取pT-Noggin质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pET41a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。序列分析表明,绵羊Noggin基因的cDNA全长编码区(GenBank登录号为FJ751853)为699bp,编码232个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列同源性达到95%以上。SDS-PAGE结果显示,诱导表达的融合蛋白大小为60ku,与预期蛋白大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白为His融合蛋白。说明成功克隆了绵羊Noggin基因的编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。

人Noggin基因神经细胞特异性表达载体的构建

目的构建具有神经细胞表达特异性的人Noggin基因的真核表达载体,进一步研究Noggin基因在神经系统发育成熟、功能机制方面的作用。方法根据人Noggin基因的cDNA序列,设计合成一对5'端分别含有HindⅢ和XbaⅠ酶切位点的特异性引物,运用RTPCR方法克隆人Noggin基因的cDNA序列;回收PCR产物,并将其与pMD18simpleT载体连接,进行HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定和DNA测序鉴定;真核表达载体pCS2+〔Tα1〕GFP带有神经细胞特异性启动子(alpha1微管蛋白启动子),用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收带有特异性启动子的片断和T载体上人Noggin基因,在T4DNA连接酶作用下将二者连接,并筛选鉴定。结果RTPCR产物含有人Noggin基因,DNA测序结果显示重组的pMD18Noggin载体中含有正确的人Noggin基因序列,重组的pCS2+〔Tα1〕Noggin载体中含有人Noggin基因的cDNA序列以及alpha1微管蛋白启动子。结论成功构建了人Noggin基因的神经细胞特异性真核表达载体pCS2+〔Tα1〕Noggin。

腺病毒介导noggin基因修饰神经干细胞

目的:以重组腺病毒介导的noggin基因修饰小鼠海马源性神经干细胞,为基因修饰的神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供依据。方法:以重组腺病毒介导的noggin基因转染体外培养的神经干细胞,MTT法检测转染前、后神经干细胞的生长活性,应用免疫细胞化学及Western blot检测转染后Noggin蛋白在神经干细胞中的表达及noggin基因对神经干细胞定向分化的影响。结果:重组腺病毒pAdEasy-1-noggin转染神经干细胞后,神经干细胞中Noggin蛋白表达持续增加;转染后的NSCs在含血清的培养液中能定向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并且其分化为神经元的数量明显增加。结论:重组腺病毒介导的noggin基因在细胞中可持续稳定表达,noggin基因能够促进神经干细胞定向分化为神经元,抑制其向星形胶质细胞方向分化,为下一步进行神经干细胞体内移植治疗提供了实验依据。

转染Noggin基因的骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞的初步研究

目的构建Noggin基因的表达载体,初步探讨转染Noggin基因的骨髓基质细胞(BMSCs)在体外分化为神经细胞的情况。方法应用RT-PCR技术,从正常人胎脑组织中扩增出Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2+Tα1-Noggin。用Percoll分离液分离出大鼠BMSCs,借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs。观察细胞形态的改变,并利用免疫组化鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果成功构建Noggin基因的真核表达载体pCS2+Tα1-Noggin。Percoll分离液分离出BMSCs,转染Noggin基因表达载体后,形似神经细胞;免疫组化检测到NSE、MAP-2表达,未检测到GFAP表达。结论转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为神经元样细胞。

榕江香猪Noggin基因的组织表达

采用RT-PCR的方法对榕江香猪Noggin基因的组织表达进行研究，结果显示，Noggin基因在大脑、卵巢、子宫表达，其中大脑的表达量显著高于卵巢和子宫组织（P〈0．05）；脾、肺、脊髓、肝、肾等组织中未检测到Noggin基因的表达；对脑、子宫和卵巢检测分子长194bp的cDNA片段进行测序后，证实表达的片段为Noggin基因，与马、人、鼠、鸡和青蛙存在2～66个碱基的差别。研究结果证实Noggin基因在香猪的大脑、卵巢和子宫中表达，对这些组织可能有直接的调节作用。

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的构建慢病毒介导的Noggin RNAi干扰序列,并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的m RNA设计四条干扰序列,并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞,利用puromycin进行筛选,获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示,四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果,但只有sh Noggin-1(P<0.01)对其表达影响显著。Western blot结果显示,四种干扰序列中只有sh Noggin-1(P<0.01)对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论获得了一种Noggin基因的干扰序列,该序列能够干扰Noggin基因m RNA的稳定性,从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因,从而用于研究Noggin基因的功能。

神经前体细胞基因调控研究进展

神经前体细胞的基因调控主要包括基因修饰、基因转录的诱导、miRNA的调控等。其中，目前研究较多的基因是HOX—B基因、Sonichedgehog基因、Noggin基因和miRNA。本文重点就这些基因对神经前体细胞的增殖和分化的调控作一综述。

Noggin基因过表达重组腺病毒载体的构建及其对骨肿瘤细胞MG63迁移侵袭能力的影响

目的:研究Noggin基因对骨肿瘤细胞MG63中Noggin,BMP-2,血管内皮生长因子(VEGF)及结缔组织生长因子(CTGF)的表达及细胞迁移侵袭的影响,探讨Noggin基因在骨肿瘤的发生和发展过程中的作用机制。方法:通过构建Noggin基因过表达重组腺病毒载体,并将其转染到骨肿瘤细胞MG63中,采用RT-PCR和Western blot分别检测空白对照组、过表达重组腺病毒组中Noggin,BMP-2,VEGF和CTGF的mRNA水平和蛋白水平,Transwell细胞迁移和侵袭能力实验考察两组细胞的迁移和侵袭能力。结果:成功构建Noggin基因过表达重组腺病毒载体,将其转染到骨肿瘤细胞MG63后,Noggin的mRNA及蛋白表达水平显著升高,BMP-2,VEGF及CTGF的mRNA及蛋白表达水平显著降低,转染Noggin基因过表达重组腺病毒的骨肿瘤细胞MG63迁移和侵袭的能力明显下降。结论:过表达Noggin基因能成功抑制骨肿瘤细胞MG63的侵袭和转移,有望成为骨肿瘤基因治疗的新方法。

NOG基因移码变异导致的听力异常家系的遗传学分析及产前诊断

目的探讨一个听力损失家系的遗传学病因,并根据基因检测结果进行产前诊断。方法对先证者进行了靶向下一代测序(next-generation sequencing,NGS),其中包含5679个与听力损失相关的基因。NGS检测到的变异通过Sanger测序进行验证,并评估其致病性,通过羊膜穿刺术进行产前诊断。结果测序分析在noggin(NOG)基因中发现了一个移码变异c.509delC(p.Pro170ArgfsTer4),该变异导致一个截断的蛋白质。目前,该突变未被任何数据库或出版物收录及报道,进一步生物信息学分析预测该变异为致病变异。产前诊断提示该胎儿没有携带同样的突变。结论对该家系的分析显示NOG基因的c.509delC(p.Pro170ArgfsTer4)突变导致先证者混合性听力损失和轻度骨骼异常,这与以往的研究不同。本研究对进一步研究NOG基因突变的临床表型和发病机制具有重要意义。