PCR-RFLP法直接检测分枝杆菌皮肤感染的临床应用

目的:评价分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)基因检测分枝杆菌皮肤感染标本的敏感性和特异性。方法:多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-砒LP)的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶法直接检测Hsp65基因,PCR-RFLP检测阳性的标本再经Hsp65基因和16S rRNA DNA基因测序验证。结果:与培养法相比,PCR-RFLP法检测临床分枝杆菌皮肤感染的敏感性为30%(3/10),特异性为100%(10/10)。结论:分枝杆菌PCR-RFLP的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶法可用于分枝杆菌皮肤感染的临床检测。

生物素标记探针-液相杂交-非变性PAGE检测非编码小RNA方法的建立和优化

目的建立生物素标记探针-液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测非编码小RNA(sRNA)的方法。方法将生物素标记的sRNAU6寡核苷酸探针经非变性PAGE电泳后转印至尼龙膜上,然后用辣根过氧化物酶(HRP)耦联链霉亲和素进行检测。从细胞中提取总RNA,用已标记U6探针优化液相杂交退火条件及杂交缓冲液;用建立的方法检测并计算BEAS-2B、A549细胞中sRNAU6与miRNA145的含量。结果将Biotin-11-dUTP成功标记至寡核苷酸上,随着寡核苷酸浓度增加,检测信号强度越强,10μmol/L时达到最强。采用水浴反应条件与采用聚合酶链反应(PCR)仪梯次降温反应条件下得到的杂化链无明显差异;以磷酸盐缓冲液作为杂交缓冲液优于Tris-HCl、DEPC水;BEAS-2B、A549细胞5μgRNA中U6含量接近;BEAS-2B细胞中miRNA145绝对含量高于A549细胞。结论成功建立并优化了sRNA检测新方法 ,为简单、易行、可靠地检测sRNA提供了可能。

鉴定水稻品种的微卫星标记筛选

选用58个水稻微卫星标记,对目前应用较广的28份杂交水稻亲本材料进行多态性分析,并比较了其中14个标记应用3.0%琼脂糖凝胶电泳和6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果。研究表明,所应用的标记可将所有供试水稻材料区分开,不同标记的多态性检测能力差异较大;两种检测方法所得结果高度一致,但非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率较高、带型清晰,能更准确反映水稻材料间的差异。对于一般水稻材料而言,选用12个标记可将不同材料区别开的几率大于99.9%,但要区分遗传相似性较高的材料,则可能需挑选高多态性标记和(或)增加检测的标记数。

微卫星DNA非变性PAGE银染法的分析探讨

微卫星DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),是一种常用的DNA检测手段,具有很好的分离微小差异DNA片段的能力,而银染法使该方法得到了广大科研工作者的青睐,但是,在染色过程中,常可能出现一些问题,令结果的判断难以达到满意的效果。为此,对该方法进行了一系列的分析和探讨。

高粱微卫星两种PAGE银染方法的比较

实验比较了高粱SSR-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳2种改良银染方法,为初次实验时选择银染方法提供参考。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对高粱抗丝黑穗病(恢复系分离群体2381R/矮四)SSR-PCR产物进行检测,分别利用改良过的硝酸银染色方法和改良过的银氨染色方法进行染色,分析2种染色方法的特点。实验结果表明,改良过的硝酸银染色具有操作时间较短、背景颜色浅等优点,适合大量筛选引物时的染色方法;改良过的银氨染色方法具有灵敏度高,显像效果好等优点,适用于基因定位等研究。为今后利用SSR-PCR标记技术研究分析高粱抗丝黑穗病奠定了基础。

低密度脂蛋白颗粒大小测定及意义

初步建立低密度脂蛋白 (LDL)颗粒大小的测定方法并探讨其意义。采用 2 0～ 16 0g/L非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳 (12～ 16℃ ,12 5V ,电泳 2 4小时 )分离LDL亚组分并进行凝胶扫描测定LDL颗粒大小的分布。在有颈动脉粥样硬化的病例组和正常对照组之间LDL亚组分分布有差异 ,前者以小而致密的B型为主 ,而后者以大而疏松的A型为主。结果表明 ,测定LDL颗粒大小对动脉粥样硬化性疾病的预测有一定的意义。

一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段DNA的方法

利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、纯化特异性小片段DNA的首选方法,也是开展后续多种分子生物学试验的前提。本试验比较了改良煮沸法(液氮研磨+煮沸+低温浓缩)、煮沸法及直取法回收小片段DNA,以回收样品模板进行第二次PCR扩增,结果表明:改良方法回收的DNA的纯度高,特异性好,回收率与经典煮沸法相当。在保证回收产物的特异性时,用低温浓缩法替代乙醇/醋酸钠共沉淀也具有可行性及一定的创新性。

烟蚜2种微卫星标记银染方法的比较

实验比较了烟蚜SSR-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳2种改良银染方法,目的是为初用者在选择银染方法时提供参考。用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测烟蚜SSR-PCR的产物,结果表明银染方法2灵敏度高、简便省时,更适于对烟蚜遗传多样性的研究。

一种新型抗癌药的蛋白质和蛋白酶分析

本文用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和活性电泳技术定性分析了河南省生物工程重点实验室研制的新型抗癌药的蛋白质和蛋白酶的种类和含量．结果表明：（１）文中方法能有效地浸提所用各材料中的有效成份；（２）不同材料所含蛋白质和蛋白酶种类有较大差异；（３）在连续浸提新型抗癌药有效成份过程中，第二次从各材料中浸提的蛋白酶活性高于第一次．综合分析表明，第二次浸提效果好于第一次．

高脂血症LDL亚类与血脂关系的研究

目的研究健康成人和高脂血症患者LDL各亚类组成,并进一步分析LDL亚类、血脂水平与动脉粥样硬化、冠心病之间的相关性。方法通过非变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳—免疫印迹法分析了87例高脂血症患者及81例正常人血清LDL各亚类含量,分布以及平均直径。结果与对照组相比,高脂血症患者血清TC、TG、LDL-C、apoB100,sdLDL水平均有显著升高;HDL-C、apoAI水平及LDL平均直径均有显著降低。两组女性HDL-C均显著高于男性,而LDL-C则显著低于男性。女性高脂血症患者及对照组女性的sdLDL均显著低于同组男性。高甘油三酯血症患者TG及sdLDL水平均显著高于高胆固醇血症患者,TC、LDL-C水平及LDL平均直径均显著低于高胆固醇血症患者。结论性别差异和血脂水平对LDL亚类分布有显著影响。血清TG水平升高作为sdLDL含量升高的主要危险因素,在AS和CHD的发生发展中起主要作用。血浆sdLDL亚类的检测对AS和CHD的早期诊断有积极意义。

甜菜SSR扩增产物不同检测方法的比较研究

利用16对甜菜SSR引物对12个不同的甜菜品种进行扩增,分别采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、3%的Metaphor琼脂糖电泳以及3%的普通琼脂糖电泳对SSR扩增产物进行检测,比较不同检测结果的差异性。结果表明:8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分辨细小条带的差异远高于3%的Metaphor琼脂糖和普通琼脂糖,而Metaphor琼脂糖的分辨率高于普通琼脂糖;但对于条带较少的引物,3种凝胶未显现出差异;对于条带数较多的引物,如果条带比较集中,3种检测方法差异显著,如果条带比较分散,3种凝胶之间的差异较小。由于Metaphor琼脂糖价格偏高、胶软不易操作且分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶,因此不建议使用。而8%的聚丙烯酰胺凝胶则适合于指纹图谱的构建以及遗传多样性分析等,普通琼脂糖可以应用在品种纯度的鉴定。

从非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速高效回收DNA片段

获得特异性的DNA是开展多种分子生物学试验的前提,具有高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳是纯化特异性DNA的首选。借助液氮对凝胶的固化作用,介绍了通过研磨破坏聚丙烯酰胺凝胶结构回收纯化DNA的方法。将通过该方法回收纯化的DNA和采用琼脂糖凝胶电泳回收纯化的DNA,经由聚丙烯酰胺凝胶电泳的进一步检测,结果显示,该方法与琼脂糖凝胶电泳回收法相比,所获得DNA的纯度高,特异性好,且效率相当。在提高DNA特异性的同时也兼具了经济高效耗时少等优点,可以广泛应用。

一种高效省本的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法的建立——以水稻为例

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染技术已广泛用于DNA片段检测。介绍一种本实验室改进的高效省本的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法,该法将固定和染色两步骤合并,整个银染过程只需16 min即可完成。同时,该法无需使用无水乙醇和冰乙酸,减少了硝酸银、氢氧化钠及甲醛的使用量。

长尾仓鼠SSR位点的筛选与扩增

利用从山西省11个地市共计13个县(市)野外捕捉的132只长尾仓鼠为试验材料,先提取其基因组DNA,然后应用查阅的近源种黑线仓鼠的6对SSR位点引物(已登记在GeneBank)对长尾仓鼠基因组DNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果表明,有5对引物扩增效果较好,可用于长尾仓鼠的遗传多样性研究。研究结果可对今后长尾仓鼠的遗传多样性分析提供一定的理论基础。

小麦幼叶ROP GTPase提取方法的优化

所有RhoG TPase组成一个特殊的亚家族,命名为ROP GTPase,这个家族参与并调控肌动蛋白细胞骨架的重组等一系列信号转导过程。小麦ROP GTPase的高效纯化技术和手段是对其功能和性质等进行研究的重要基础和关键,并且这对小麦ROP GTPase关于信号转导以及F-actin的研究有着极为重要的理论和实践意义。采用凝胶过滤层析和分辨率较高的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)等技术对小麦的ROP蛋白进行了提取、纯化和鉴定。

不同检测方法对甜菜SCoT和DAMD扩增产物多态性的影响

为筛选更优的SCoT和DAMD扩增产物多态性的检测方法,为构建甜菜品种分子身份证,建立一套快速鉴定甜菜品种真实性的体系提供依据。试验以8个不同的甜菜品种对7条DAMD引物和15条SCoT引物进行筛选,选出多态性最好,分辨率最高的核心引物;再利用1%、2%琼脂糖凝胶和6%、8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶两种电泳方法对扩增产物的多态性进行检测并对比分析。结果表明,从7条DAMD引物和15条SCoT引物中筛选出6条带型清晰,多态性高的核心引物。这6条核心引物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物时,条带难以分离辨认;而在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中共扩增出131条带,其中130条为多态性条带,总多态性占比为99.2%。同时在用1%的琼脂糖凝胶检测产物的条带图虽能显示一定的多态性,但条带分离较差,出现重叠的情况;2%琼脂糖凝胶电泳中,扩增总条带57条,43条多态性条带,总的多态性占比为75.4%;前者扩增的总条带数比后者扩增出的总条带数多了近2.3倍,而在总多态性占比中,前者是后者的3倍。因此非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳的检测更适于对DAMD和SCoT扩增产物的检测,用于构建甜菜品种指纹图谱构建,这种需要检测样品数量大,且需获得更准确遗传信息的研究,可以提高检测效率。