H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定

研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的神经氨酸酶(NA)蛋白。试验为获得具有良好反应原性的NA蛋白,将H5N1亚型AIV(DK/YN/S4469/2022)密码子优化后的N1基因插入载体pFastBac1,构建的重组转移载体pFastBac1-N1转化至DH10Bac感受态细胞,经过蓝白斑筛选获得阳性重组杆粒rBacmid-N1,然后将重组杆粒转染至sf9昆虫细胞,获得N1亚型重组杆状病毒。结果显示:N1重组蛋白在sf9昆虫细胞中正确表达,并且该重组蛋白具有良好的反应原性,能够与N1蛋白单克隆抗体3F3发生特异性反应,其仅能识别N1亚型鸡血清,特异性较好。研究成功制备了N1重组蛋白,为NA蛋白表达方法提供参考并为临床血清样品的N1抗体检测方法的建立奠定基础。

黑龙江省高致病性禽流感、新城疫免疫抗体集中监测情况与分析

为评估高致病性禽流感疫苗和新城疫疫苗的免疫效果,以期对我省禽病防控政策制定提供数据支持,试验采用血凝试验和血凝抑制试验对黑龙江省13个地市采集的7793份家禽血清样品分别检测H5亚型、H7亚型高致病性禽流感抗体水平,并对其中2547份家禽血清进行了新城疫抗体检测。结果显示,2021—2023年H5亚型禽流感免疫抗体合格率依次为95.90%(Re-11株)、77.01%(H5-Re13株)和96.43%(H5-Re13株);H7亚型禽流感免疫抗体合格率依次为94.37%(Re-3株)、77.96%(H7-Re4株)和96.60%(H7-Re4株),新城疫免疫抗体合格率依次为97.46%、83.66%和94.44%。13个地市免疫抗体监测结果显示,H5亚型禽流感免疫抗体合格率为82.88%~100.00%,H7亚型禽流感免疫抗体合格率为79.50%~99.01%,新城疫免疫抗体合格率为74.20%~100.00%;不同场点H5亚型禽流感免疫抗体合格率分别为规模场94.65%、散养户89.33%,H7亚型禽流感免疫抗体合格率分别为规模场95.03%、散养户87.74%,新城疫免疫抗体合格率分别为规模场96.13%、散养户89.23%。各项免疫抗体合格率均高于国家规定的70%,由此说明我省高致病性禽流感疫苗和新城疫疫苗免疫效果良好。

不同家禽红细胞悬液对禽流感血清抗体检测的影响

为探讨不同家禽红细胞对禽流感血清抗体检测的影响,对不同家禽的禽流感阳性血清分别经不同方法处理后,做了一系列对比试验。结果发现,经受体破坏酶(RDE)处理后,虽然可以消除异种家禽血清对异种家禽红细胞的非特异性凝集作用的影响,但因处理复杂,费用高,不宜推广应用;经鸡红细胞吸附处理,可明显降低水禽血清对异种红细胞的非特异性凝集作用,但处理费时;而用水禽红细胞检测同种水禽的禽流感血清抗体,可以有效去除血清非特异性凝集的影响,且更能准确地反映水禽经禽流感疫苗免疫后的抗体水平。因而,应选用与宿主来源相同的红细胞悬液检测水禽禽流感血清抗体。

禽霍乱免疫母鸡血清抗体和蛋黄抗体消长规律及其相互关系的研究

通过对禽霍乱菌苗免疫产蛋母鸡的血清和蛋黄的抗体定时检测后发现，免疫母鸡的血清抗体和蛋黄抗体的升降趋势基本一致（ｒ＝０．９４），但后者较前者迟后３～６ｄ；血清抗体和蛋黄抗体的滴度分别在加强免疫后的１～３ｄ和３～６ｄ都有不同程度下降，加强免疫前的滴度越高，免疫后的滴度下降幅度越大；蛋黄抗体水平普遍比血清抗体水平低，两者间的差异极显著（Ｐ＜０．０１），这可能是与禽多杀性巴氏杆菌本身的主要抗原成分（ＴＩ抗原）在鸡体内主要产金ＩｇＭ有关。

禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备

从英国中心兽医实验室（ＣＶＬ）引进禽流感病毒１４种血凝素亚型（Ｈ１～Ｈ１４）的标准毒株，经９～１１日龄的ＳＰＦ鸡胚增殖、传代后收取感染鸡胚的羊水及尿囊液，经１０００ｘｇ离心１５分钟后，收取上清作为免疫原。取８只１２周龄ＳＰＦ鸡分成Ａ、Ｂ两组，进行人工感染鸡的抗体消长规律试验。选用Ｈ３毒株制备的免疫原，按１ｍｌ／只的剂量翅静脉接种Ａ、Ｂ两组的８只ＳＰＦ鸡，１周后Ｂ组的４只鸡复免一次，分别用ＨＩ和ＡＧＰ试验测定２种方法免疫鸡的抗体水平．监测结果表明：经１次免疫的鸡（Ａ组）于免疫后１５天ＨＩ抗体升至最高，以后抗体逐渐下降，且产生的抗体个体差异不大，ＡＧＰ试验结果只有于免疫后２０～５５天内全部为阴性；经重复免疫的鸡（Ｂ组），于初免后１５～４５天内ＨＩ抗体都维持较高水平，且产生的抗体个体差异不大，ＡＧＰ试验结果在初免疫后１５７５天内全部为阳性。据此，我们根据禽流感病毒株毒力的强弱（参照其ＥＩＤ５０，用纯化后的鸡胚尿囊液制备的免疫原，按０５～２５ｍｌ／只的剂量分别免疫１２周龄ＳＰＦ鸡，１周后加强免疫一次于二免后１０～１５天放血，制备出禽流感病毒１４个血凝素亚型的分型血清，并有霍乱滤液（ＲＤＥ）法对血清进行了处理。

禽源大肠杆菌的生物表型特性

对243株禽源大肠杆菌分离株进行血清耐受试验、菌毛化大肠杆菌血凝试验和温度敏感性血凝素试验,在这些分离株中,高度血清耐受、中等血清耐受、轻度血清耐受和血清敏感菌株分别占受试菌株的57.2%(139/243)、28.8%(70/243)、10.3%(25/243)和3.7%(9/243)。在37℃细菌培养物与鸡红细胞凝集试验中,甘露糖敏感血凝(MSHA)和甘露糖耐受血凝(MRHA)菌株分别占受试菌株的64.6%(157/243)和5.8%(14/243);与豚鼠红细胞凝集试验中,MSHA和MRHA菌株分别占受试菌株的74.9%(182/243)和2.9%(7/243),其中与鸡红细胞凝集试验MSHA菌株中,MSHA阳性菌株占高致病株的69.5%(132/190),MRHA阳性菌株占低致病株的22.2%(2/9),两者差异极显著(p<0.01)。在温度敏感性血凝素试验中,MRHA菌株为112株,占分离株的46.1%,其中O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的83%～100%,而其它血清型的高致病株仅占57%左右,差异显著(p<0.05)。结果显示禽源大肠杆菌的致病性与其血清耐受能力、鸡红细胞MSHA菌毛的表达和温度敏感性血凝素的表达呈一定的相关关系。

蛋鸡血清与卵黄中禽流感病毒抗体的相关性

用禽流感 (AI)H9N2油乳剂灭活疫苗免疫非免疫蛋鸡 ,并于免疫后第 0、3、5、7、9、11、13、15、17、19、2 1、30d分别测定血清及卵黄中的AI血凝抑制试验 (HI)及琼脂扩散凝集试验(AGP)抗体。结果显示 ,免疫后第 7d卵黄中即可检出HI及AGP抗体 ,以后逐渐上升 ,在免疫后第 19～ 2 1d达高峰值 ,与血清的HI抗体水平接近 ,差异不显著 (P >0 .0 5 )。表明通过对鸡蛋卵黄AIV抗体检测 ,可以进行AI的疫情监测 。

SPF鸡感染禽白血病病毒A/B亚群后血清抗体与卵黄抗体的变化及其相关性

拟研究以卵黄抗体替代血清抗体检测判定SPF鸡群禽白血病病毒(ALV)感染状态的可行性。在人工接种ALV-A/B后的40只SPF鸡刚开产时,从21只抗体阳性鸡及19只抗体阴性鸡分别采集血清和卵黄并一一对应,比较卵黄不同稀释度与血清中ALV-Ab抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。另外36只同批次不攻毒的SPF鸡单独饲养作为对照,76只鸡在25~34周龄期间,每隔3周分别采集1次血清,每周采集1次种蛋,共采集了304份血清样品及836份卵黄样品。所有血清和卵黄抗体用IDEXX的ALV-Ab抗体ELISA检测试剂盒检测。血清按试剂盒规定的1∶500稀释,卵黄按预试验结果选定稀释度稀释。同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品,严格在同一次ELISA试验中检测。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄做1∶300稀释时,假阳性和假阴性最少,确定1∶300为卵黄最适稀释度。在25~34周龄,836份卵黄抗体的检测判定结果与304份血清抗体检测结果吻合率达94.7%,即这些血清抗体阳性鸡同时期采集的卵黄抗体也全部阳性,血清阴性鸡的卵黄抗体也均为阴性。结果提示疫苗生产企业可通过检测SPF种蛋的卵黄抗体来判断SPF鸡场对ALV的洁净度。

J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×105。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的血清学分型研究

本文运用气管环血清中和试验对１２个ＩＢＶ毒株进行了血清型研究。以气管环纤毛运动为指示系统，以能中和２．０ｌｏｇ１０ＣＤ５０同源病毒血清效价为１个抗体单位，含２０个抗体单位的血清与等量病毒作用测定血清对纤毛运动保护百分率，以欧氏距离数字分类分型，并用ＳＰＳＳ软件聚类分型分析。结果表明ＳＡＩＢ１属Ｍ４１型，ＳＡＩＢ３属Ｔ型；ＸＪＩＢ接近Ｍ４１型，ＳＨＩＢ、ＳＡＩＢ２接近Ｔ型。ＸＪＩＢ，ＳＨＩＢ，ＳＡＩＢ２具有过渡性（变异性）特征。

一株鸭源H5N1亚型禽流感病毒人工感染鸡的病理学研究

鸡经肌肉或眼-鼻-口腔-泄殖腔接种禽流感病毒A/duck/Guangdong/220/2004(H5N1)后,发病率和死亡率均为100%,死亡发生在接种后6d内。全身多数器官出现充血、淤血、出血、血栓形成、组织水肿和炎症,主要有血管炎、病毒性心肌炎、病毒性肝炎、气管炎、出血性卡他性肺炎、肾小管性肾炎、肾小球性肾炎、坏死性胰腺炎、坏死性胸腺炎、坏死性法氏囊炎、脾炎、非化脓性脑炎、溃疡性肠炎等。电镜下可见心、肝、肾、胰、脾、胸腺等器官的实质细胞发生坏死和凋亡两种变化。鸡接种该病毒后,通常血清中的天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶)、γ-谷氨酰基转移酶、碱性磷酸酶先升高,后下降;而肌酸激酶则升高,α-淀粉酶则下降。结果表明,许多器官的严重损伤是造成鸡死亡的原因,而该病毒的致病机制可能与细胞坏死和细胞凋亡有关。

2011年楚雄州禽流感职业人群和环境监测结果分析

目的了解云南省禽流感职业暴露人群及外环境禽流感病毒H5、H9感染状况.方法采集与禽类动物有接触史的职业人群血清标本400份,采用马红细胞血凝抑制试验检测H5N1流感抗体;采集外环境480份标本,用PCR法检测FluA、AH5和AH9及AN1和AN2亚型.结果 400份职业人群血清标本检测结果均为阴性;480份外环境标本检出FluA阳性9份(阳性率1.88%);AH5亚型阳性3份(0.63%),AH9亚型阳性5份(1.04%).结论云南省所监测的活禽市场存在禽流感病毒,职业暴露人群应做好个人防护,减少感染机会.

安徽省地方品种鸡J-亚群禽白血病感染状况的血清学研究

[目的]了解安徽省优良地方品种鸡群中禽白血病病毒J-亚群(ALV-J)的感染状况。[方法]对安徽省8个鸡场、7个不同地方品种鸡开展了ALV-J感染的血清学调查。[结果]安徽省被检测鸡场均存在ALV-J感染,被检测鸡群个体阳性率高达49.9%,甚至部分鸡场鸡群个体阳性率高达86.2%。AHDF5品种鸡个体阳性率高达86.2%,其次为AHDF2、AHDF6、AHDF3、AHDF7、AHDF4和AHDF1品种鸡。4个周龄段的鸡群均有ALV-J抗体阳性鸡,但存在一定程度的差异.12周龄以下鸡群ALV-J阳性感染率相对较低,为7.1%;随着周龄的增大,ALV-J阳性率总体上呈现上升趋势,最高达50%。[结论]安徽省地方品种鸡中ALV-J的感染非常严重,应及早对ALV-J进行净化和采取综合防控措施。

流感病毒聚合酶PA亚单位抗血清的制备

本研究采用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/11/00中分段及全长扩增PA基因片段,将目的基因定向克隆至原核表达载体pET-32a,经测序验证正确后,获得重组阳性质粒,将重组质粒转化BL21细菌后诱导,实现质粒在大肠杆菌中的表达,重组表达蛋白经Ni+柱纯化后分别与弗氏免疫佐剂乳化成油乳剂苗免疫新西兰大耳白兔,获得抗PA的免疫抗血清。Western blot检测结果表明抗血清与目的蛋白发生特异性反应。同时,将PA全长基因插入真核表达载体pCAGGS,转染293T细胞,通过激光共聚焦显微镜发现,抗血清与PA基因的真核表达产物发生反应,出现特异性荧光,在细胞核与细胞浆中均出现荧光,进一步表明PA亚单位在细胞核与细胞浆均有分布。

K亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备及其特异性鉴定

为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的单因子血清,本试验将ALV-K接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005bp ALV-K-gp85和510bp ALV-K-gp85(fragment)基因。将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达蛋白常规免疫昆明白小鼠制备抗血清。结果表明成功获得39.85和22.01ku的重组融合蛋白,且具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明两血清均可与ALV-K反应,而不与ALV-A、ALV-B和ALV-J反应。本试验首次研制获得能特异性识别ALV-K的单因子血清,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达及其单因子血清的制备

为了制备特异性识别H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的单因子血清,本试验提取H9N2亚型AIV RNA,RT-PCR后,分别扩增上段HA1、中段HA2和下段HA3 3段基因。将他们插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达的蛋白常规免疫昆明白小鼠,以制备抗血清。结果显示,成功获得3段重组融合蛋白,且均具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,上段HA1、中段HA2制备的单因子血清均可与H9N2亚型AIV反应,而下段HA3则不能。重组马立克氏病病毒(MDV)MZC12 HA/NA同样证明HA1、HA2两段制备的单因子血清能识别HA基因的表达。本试验成功制备了识别H9N2亚型AIV HA的单因子血清,为H9N2亚型AIV的鉴别诊断及研究奠定了基础。

SPF鸡感染J亚群禽白血病病毒血清抗体与卵黄抗体的变化动态及其相关性

为研究以卵黄抗体替代血清抗体判定SPF鸡群J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染状态的可行性,人工接种ALV-J的SPF鸡23周龄时,分别从25只抗体阳性鸡及22只抗体阴性鸡采集血清和卵黄,比较不同稀释度的卵黄与血清中ALV-J抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数.结果表明,相对于血清抗体,将卵黄1∶400稀释,假阳性和假阴性最少,确定1∶400为卵黄最适稀释度.对40只攻毒SPF鸡和36只同批次单独饲养的空白SPF鸡在25～34周龄,每隔3周采集一次血清,每周采集一次种蛋,共采集304份血清样品和760份卵黄样品.血清按1∶500稀释,卵黄按1∶400稀释,所有血清和卵黄抗体用美国IDEXX公司ALV-J抗体ELISA检测试剂盒检测,同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品严格在同一次ELISA中检测.结果显示,在25～34周龄,卵黄抗体检测判定结果与血清整体吻合率为82.5％～95％.上述结果表明用卵黄抗体替代血清样品检测来监控SPF鸡群对ALV-J的感染状态是可行的,疫苗生产企业可通过抽检SPF鸡场提供SPF种蛋的卵黄抗体水平来判断SPF鸡场的洁净度.

Ⅱ群禽腺病毒五邻体蛋白单因子血清的制备

通过PCR方法扩增得到Ⅱ群禽腺病毒火鸡出血性肠炎病毒(HEV)的五邻体(penton)基因,并构建了原核表达载体pET-32a-penton,将其转化至E.coil BL21中,通过诱导表达,以切胶回收的方式纯化蛋白,获得约70ku的重组融合蛋白,Western blotting检测纯化后的重组蛋白具有较好的抗原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了五邻体蛋白单因子血清,间接ELISA检测结果显示所制备的抗血清效价大于1∶40000。本试验获得的高效单因子血清,为Ⅱ群禽腺病毒特异性检测方法的研究奠定了基础。

枇杷叶提取物对人工感染IBV生化指标及抗体影响

试验旨在研究枇杷叶提取物对人工感染IBV的雏鸡血清生化指标及IBV抗体水平的影响。将108羽1 d雏鸡随机分为6组,每组3个重复,每个重复6羽。第14天时,除空白对照组外,其余5组滴鼻感染IBV。攻毒48 h后分别以0.01%利巴韦林,0.6%、0.8%和1.0%枇杷叶提取物进行药物试验,阳性对照组不给药。结果表明:与阳性对照组相比,各药物试验组的尿素氮、肌酐、天门冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶及丙氨酸转氨酶差异显著(P<0.05);在28 d时,枇杷叶提取物各剂量组血清IBV抗体水平差异极显著(P<0.01)。本试验表明枇杷叶提取物对人工感染IBV的雏鸡肝功能及肾功能有显著保护作用,能提高IBV抗体水平,且以0.8%的枇杷叶提取物组为佳。

121例艾维茵肉用仔鸡血浆蛋白含量水平及频数分布的研究

本文对１２１例３８日龄艾维茵肉鸡的各类血浆蛋白含量进行了检测分析，得出各类血浆蛋白的平均含量分别为：总蛋白４．５６６ｇ％、清蛋白１．９６６ｇ％、α１－球蛋白０．５２７ｇ％、α２－球蛋白０．５８８ｇ％，β－球蛋白０．８９０ｇ％，γ－球蛋白０．５８５ｇ％。从频数分布情况来看，清蛋白和γ－球蛋白呈正态分布，α１－球蛋白接近正态分布，其余均为偏态分布。