有氧运动训练影响阿尔茨海默症小鼠海马Notch1、Caspase-3的表达

背景:β-淀粉样蛋白和Tau蛋白会对阿尔茨海默症患者的认知功能产生不良影响,研究发现Notch1及Caspase-3能够调控β-淀粉样蛋白和Tau蛋白的表达。Notch1及Caspase-3是否介导了有氧运动改善阿尔茨海默症患者认知能力的过程还不清楚,目前缺乏长期有氧运动影响阿尔茨海默症小鼠海马中Notch1及Caspase-3表达的研究。目的:观察长期有氧运动干预阿尔茨海默症小鼠的空间学习记忆情况及其海马中Notch1及Caspase-3的表达,探讨Notch1及Caspase-3对阿尔茨海默症小鼠的影响。方法:将3月龄野生型及APP/PS1双转基因阿尔茨海默症小鼠随机分为4组:野生对照组、野生运动组、阿尔茨海默症对照组、阿尔茨海默症运动组,每组20只。对照组小鼠不进行运动,运动组小鼠进行5个月的有氧运动干预。运动干预结束后,采用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力;采用Real-timePCR、免疫荧光及Westernblot检测各组小鼠海马组织Aβ_(1-42)、Tau、Notch1及Caspase-3蛋白的表达。结果与结论:①阿尔茨海默症小鼠空间学习记忆能力显著差于野生组(P<0.05);运动组小鼠空间学习记忆能力显著优于对照组(P<0.05);②阿尔茨海默症对照组小鼠海马Aβ_(1-42)、Tau、Notch1及Caspase-3表达均显著高于野生对照组(P<0.05);阿尔茨海默症运动组小鼠海马Aβ_(1-42)、Tau、Notch1及Caspase-3表达显著低于阿尔茨海默症对照组(P<0.05);③提示:长期有氧运动干预能够改善阿尔茨海默症小鼠的空间学习记忆能力,而这可能与有氧运动降低阿尔茨海默症小鼠海马Notch1、Caspase-3、Aβ_(1-42)及Tau蛋白表达有关。

斑马鱼notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用

研究旨在通过双荧光素酶报告基因实验探究斑马鱼notch1a和notch1b基因对hsp70的调控作用。通过NCBI数据库检索获取了斑马鱼notch1a和notch1b基因的CDS序列,对其胞内段(Notch1a/Notch1b intracellular domain,N1aICD/N1bICD)进行克隆并构建pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体,在人胚肾细胞(HEK293T)中用Western Blot和亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD的表达。通过生信分析并克隆斑马鱼hsp70启动子序列,构建pGL3-hsp70-pro报告基因,并在HEK293T中检测该报告基因的双荧光素酶活性。之后在HEK293T细胞中过表达notch1a和notch1b基因,通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-hsp70-pro的活性变化,以此探究notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用。实验结果显示真核表达载体pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD构建成功,Western Blot显示pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD可正常表达,亚细胞定位显示N1aICD和N1bICD蛋白表达在HEK293T的细胞核中;双荧光素酶实验显示pGL3-hsp70-pro报告基因在HEK293T细胞中具有活性,是阴性对照质粒的3.7倍;在HEK293T细胞中pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体能够显著增强pGL3-hsp70-pro的活性,分别为对照组的4.9倍和5.1倍。实验结果表明斑马鱼notch1a和notch1b基因可显著增强hsp70基因的表达,为进一步研究Notch分子通过Hsp70进行抗感染免疫的分子机制提供了实验材料并奠定了理论基础。

Notch信号通路在成人EB病毒感染所致传染性单核细胞增多症中的作用

目的:观察成人传染性单核细胞增多症(IM)患者Notch信号通路分子和Th22细胞的变化,检测抑制Notch信号通路对Th22细胞的调控作用。方法:纳入42例IM患者和21例健康对照者,采集外周血,分离血浆和外周血单个核细胞,酶联免疫吸附试验检测血浆白细胞介素(IL)-17和IL-22水平,流式细胞术检测CD3+CD4+IL-17+Th17细胞和CD3+CD4+IL-22+Th22细胞比例,实时定量PCR法检测Th17转录因子维甲酸相关孤独核受体γt(RORγt)、Th22转录因子芳香烃受体(AhR)及Notch信号通路分子(包括Notch受体、Notch配体、Notch下游分子)mRNA相对表达量。纯化CD4+T细胞,使用γ-分泌酶抑制剂(GSI)刺激培养,检测GSI刺激后细胞增殖、Th17和Th22细胞比例、IL-17和IL-22分泌、转录因子mRNA相对表达量变化。结果:IM组外周血单个核细胞中Notch1和Notch2 mRNA的相对表达量分别为13.58±3.18、4.73±1.16,均明显高于对照组的1.09±0.12、1.07±0.15(均P<0.001),而Notch3和Notch4 mRNA相对表达量在IM组和对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。IM组Notch配体DLL1和Jagged1 mRNA相对表达量、Notch信号下游分子Hes1、Hes5和Hey1 mRNA相对表达量均高于对照组(均P<0.001)。IM患者Th17和Th22细胞比例分别为5.03%±1.15%、4.48%±1.29%,均高于对照组的4.36%±0.82%、3.83%±0.55%(均P<0.05);血浆IL-17和IL-22水平分别为(301.1±53.82)pg/ml、(101.2±16.45)pg/ml,均高于对照组的(237.2±72.18)pg/ml、(84.75±11.83)pg/ml(均P<0.001);RORγt和AhR mRNA相对表达量分别为1.25±0.22、1.21±0.12,均高于对照组的0.99±0.15、1.04±0.11(均P<0.001)。CD4+T细胞增殖水平、Th17细胞比例、IL-17分泌和RORγt mRNA相对表达量在无GSI刺激组和经GSI刺激组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。经GSI刺激后Th22细胞比例、IL-22分泌和AhR mRNA相对表达量较无GSI刺激降低(均P<0.05)。结论:Notch信号通路通过AhR调控IM患者CD4+T细胞分泌IL-22,Notch-AhR-Th22细胞通路可能参与IM发病。

牛蒡子苷元调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究牛蒡子苷元(ARC)通过调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌(OSCC)HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其机制。方法:使用不同质量浓度的ARC处理人HSC-3细胞,CCK-8法检测ARC对细胞增殖活力的影响,以选择适宜的药物浓度。将HSC-3细胞分为对照组、ARC-L组(10 mg/L ARC)、ARC-M组(20 mg/L ARC)、ARC-H组(40 mg/L ARC)和ARC-H+Jagged1/FC组(40 mg/L ARC+1.2μg/mL Jagged1/FC)。采用EdU法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞的迁移、侵袭能力及细胞周期和细胞凋亡率,WB法检测增殖(c-Myc、cyclin D1)、凋亡(BAX、Bcl-2、survivin)、EMT(E-cadherin、vimentin、Snail)及Notch/Hes-1通路(Notch 1、Hes-1、NICD)相关蛋白的表达水平。结果:与0 mg/L相比,10~80 mg/L的ARC均能显著降低HSC-3细胞增殖活力(均P<0.05)。与对照组相比,ARC-L组、ARC-M组和ARC-H组HSC-3细胞EdU阳性率、划痕愈合率、侵袭细胞数、S期和G2/M期细胞占比及c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、survivin、vimentin、Snail、Notch 1、Hes-1和NICD蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率、G0/G1期细胞占比及BAX、E-cadherin的蛋白表达均显著升高(均P<0.05),且呈浓度梯度依赖性。同时使用Notch激动剂Jagged1/FC,则可部分逆转ARC对HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的作用(均P<0.05)。结论:ARC可能通过抑制Notch/Hes-1信号通路抑制OSCC细胞HSC-3增殖和侵袭并促进细胞凋亡。

miR-145通过Notch通路调节免疫功能及炎症反应介导创伤性脑损伤的神经保护

目的:探讨miR-145对创伤性脑损伤(TBI)后炎症反应和免疫调节的作用。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(TBI)、TBI+NC agomir组、TBI+miR-145 agomir组。改良神经损伤严重程度评分(mNSS)用于评估创伤后神经功能;MWM测试评估TBI后小鼠的神经认知功能;流式细胞术检测各组小鼠脑组织中Tregs数量;ELISA检测各组小鼠海马中炎症细胞因子表达;免疫组化检测各组小鼠海马中活化的小胶质细胞/巨噬细胞Iba-1表达;RT-qPCR检测M1/M2小胶质细胞/巨噬细胞标志物基因iNOS、CD11b、CD206和Arg1表达;TUNEL染色和神经元细胞核免疫荧光标记(NeuN)的双重染色检测神经元凋亡。结果:与Sham组比较,TBI组小鼠海马组织中miR-145表达显著降低,神经功能损伤增加,脑组织中Tregs在CD4+T细胞群中百分比降低,海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β表达显著升高,活化的小胶质细胞/巨噬细胞Iba-1数量增多,iNOS、CD11b、CD206和Arg1表达水平显著升高,神经元凋亡升高,Notch1、p21和Hes1 mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05);与TBI+NC agomir组比较,TBI+miR-145 agomir组小鼠海马中miR-145表达显著升高,神经功能损伤减轻,脑组织中Tregs在CD4+T细胞群中的百分比显著升高,海马中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低,抗炎因子IL-4、IL-10和TGF-β表达显著升高,活化的小胶质细胞/巨噬细胞Iba-1数量显著减少,iNOS和CD11b表达降低,CD206和Arg1表达水平显著升高,神经元凋亡减少,Notch1、p21和Hes1 mRNA和蛋白水平均显著降低(均P<0.05)。结论:miR-145过表达通过提高Tregs水平,促进小胶质细胞M2极化,调节创伤后神经炎症反应及改善行为功能障碍,这一机制可能通过Notch信号通路介导。

膝骨关节炎患者滑膜与关节液中Notch通路相关蛋白变化的意义

目的探讨膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)患者滑膜与关节液中Notch通路相关蛋白(Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5)的变化水平及意义。方法选取2021年1月至2022年12月重庆医科大学附属大足医院收治的80例膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)患者为研究对象(KOA组),另选取同期医院收治的30例半月板损伤患者为对照(对照组)。采用Kellgren-Lawrence(K-L)分级及Lequesne MG量表评价KOA病情严重程度。分别采用酶联免疫吸附试验、免疫组织化学染色检测关节液及滑膜组织中Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5表达水平。用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线对Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5诊断KOA的价值进行分析。结果KOA组关节液和滑膜组织中Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5表达水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。K-L分级越高,关节液和滑膜组织中Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5表达水平越高(P<0.05)。KOA患者关节液和滑膜组织中的Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5表达水平分别均与Lequesne MG量表评分呈正相关(P<0.05)。关节液中Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5对KOA诊断的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.563、0.786、0.600、0.453、0.543,5指标联合的AUC为0.710;滑膜组织中Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5对KOA诊断的AUC分别为0.467、0.671、0.572、0.551、0.456,5指标联合的AUC为0.787;将关节液、滑膜组织中Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2和Hes5共同进行联合,AUC为0.845。结论KOA患者滑膜及关节液中Notch通路发生异常变化,Notch通路相关蛋白(Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Hes5)的检测有助于诊断KOA并评估病情严重程度。

Notch3/DLL4信号通路对颈部淋巴水囊瘤后淋巴管发育的影响

目的:探究Notch3/DLL4信号通路对颈部淋巴水囊瘤(CH)后淋巴管成熟发育的影响。方法:选取C57BL/6小鼠和C57BL/6背景Notch3基因敲入小鼠,将两种小鼠分为正常组(对照组)和Notch3基因敲入组(突变组)。选取F2代小鼠处死,取小鼠颈部淋巴结分别进行HE染色、Masson染色、RT-qPCR、Western blot、免疫组化检测。结果:HE及Masson染色结果显示,与对照组比,突变组小鼠的淋巴结构被显著破坏,细胞纤维化严重。RT-qPCR结果显示,与对照组比,突变组小鼠淋巴结中DLL4、Hes1和VEGFR3 mRNA表达显著下降(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比,突变组小鼠淋巴结中DLL4、Hes1和VEGFR3蛋白表达显著下降(P<0.05)。免疫组化结果显示,与对照组相比,突变组小鼠淋巴结中DLL4、Hes1、Ang2、VEGFA和VEGFR3染色较浅,蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:Notch3/DLL4信号通路能够调控小鼠颈部CH的形成,其机制可能与淋巴管发育有关。

天麻素通过Notch通路抑制MCAO大鼠脑梗死急性期炎症反应

目的研究天麻素在MCAO大鼠脑梗死急性期对炎症的抑制作用及其作用机制。方法将SD大鼠分为正常组、假手术组、模型组及天麻素组,采用MCAO方法将后两组建立大鼠脑梗死模型,天麻素组每天给予腹腔注射天麻素,剂量为100 mg/kg。其余各组腹腔注射相同体积的生理盐水。并在1,3,7d 3个时间点取材,采用Western blot法分析梗死半球内炎性因子NF-κB、TNF-α、INF-γ以及Notch通路相关蛋白Notch1、Hes1、Hes5的含量。结果大鼠进行MCAO造模后1周内,患侧大脑半球内的炎性因子NF-κB、TNF-α、INF-γ均有不同程度的升高(P<0.05),而天麻素能够使其含量降低(P<0.05)。而且,MCAO造模后,大鼠患侧大脑半球中Notch1、Hes1、Hes5蛋白表达明显增高(P<0.05),而天麻素能够使Notch通路相关蛋白进一步升高(P<0.05)。结论天麻素能够抑制MCAO大鼠脑梗死急性期炎性反应,其作用机制可能与调控Notch通路有关。

乳岩宁对三阴乳腺癌荷瘤裸鼠Notch1信号通路的作用机制

目的 观察乳岩宁方与卡培他滨联用对MDA-MB-231乳腺癌荷瘤裸鼠的瘤组织中Notch1信号通路的作用。方法 用对数生长期的MDA-MB-231细胞悬液,于裸鼠左侧胸壁接种,成功长出瘤组织后将其移植到未接种裸鼠的胸壁,建立三阴乳腺癌模型,共40只荷瘤裸鼠,分5组,每组8只,日1次灌胃,连续21 d灌药。观察裸鼠状态并计算肿瘤组织的抑制率;免疫印迹法测定Notch 1、Notch1受体的细胞内结构(Notch1 intracellular domain, NICD1)、与YRPW基序相关的发状分裂增强子1(Hairy and enhancer of split related with YRPW motif 1,Hey1)、发状分裂相关增强子1(Hairy and enhancer of split Homolog 1,Hes1)、髓细胞增生原癌基因(Cellular myelocytomatosis oncogene, C-myc)的蛋白表达量;实时荧光定量PCR测定Notch 1、Hey1、Hes1、C-myc的基因表达量。结果 与模型组对比,中药、西药和中药+西药组的肿瘤质量均有明显减轻,差异有统计学意义(P<0.01),3组的抑瘤率分别为33.11%、59.60%、65.93%。免疫印迹法结果表明,与模型组相比,中药组、西药组、中药+西药组的Notch 1、NICD1、Hey1、Hes1、C-myc蛋白水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);而Notch 1和Hes1的蛋白表达水平在中药组和西药组中水平相当,差异无统计学意义(P>0.05);中药+西药组较西药组中Hes1蛋白表达水平明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量结果表明,与模型组相比,中药组、西药组、中药+西药组Notch 1、Hey1、Hes1、C-myc的mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与西药组相比,中药组与西药组Notch 1、Hes1、C-myc的mRNA水平相当,差异无统计学意义(P>0.05);中药+西药组较西药组中Notch 1及Hey1的mRNA水平明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 疏肝理气中药复方乳岩宁能够抑制三阴乳腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长,其作用机制与三阴乳腺癌中的Notch1信号通路受到抑制相关。为疏肝理气中药治疗三阴乳腺癌,尤其是影响乳腺癌Notch1信号通路方面提供了实验依据。

川楝素调节Notch信号通路对甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 研究川楝素通过调节Notch信号通路对甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 体外培养人甲状腺癌细胞8505C,CCK-8法检测不同剂量川楝素对8505C细胞存活率的影响;将8505C细胞分为对照组、川楝素-L、M、H组、川楝素+DAPT(Notch信号通路抑制剂)组;EDU法检测8505C细胞增殖;Transwell检测8505C细胞迁移与侵袭能力;RT-PCR检测不同8505C细胞组Notch1、HES1、HEY1、Ki67、MMP-2的mRNA水平;western blot检测不同8505C细胞组Notch1、HES1、HEY1、Ki67、MMP-2的蛋白水平。结果 与对照组相比,川楝素-L、M、H组8505C细胞EDU阳性细胞率、迁移与侵袭细胞数、Ki67、MMP-2的mRNA以及蛋白水平均显著性降低,Notch1、HES1、HEY1的mRNA以及蛋白水平显著性升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);与川楝素-H组相比,川楝素+DAPT组EDU阳性细胞率、迁移与侵袭细胞数、Ki67、MMP-2的mRNA以及蛋白水平均显著性升高,Notch1、HES1、HEY1的mRNA以及蛋白水平显著性降低(P<0.05)。结论 川楝素可能通过激活Notch信号通路,抑制甲状腺癌细胞8505C增殖、迁移和侵袭。

Notch信号通路在呼吸道变态反应性疾病发生发展中的调控作用

呼吸道变态反应性疾病包括变应性鼻炎(allergicrhinitis,AR)和支气管哮喘(bronchial asthma,BA)。众所周知,AR是一种人体在接触变应原后产生的、由特异性免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介导的Th2型鼻黏膜慢性非感染性炎症反应,其临床表现包括鼻塞、鼻痒、喷嚏和流涕等。AR的全球平均发病率高达5%~50%,这不仅会严重影响患者的生活质量,还是引发哮喘的一个独立高危因素[1]。《中国变应性鼻炎诊治指南(英文版)》(2018年)[2]指出,40%的AR患者可合并哮喘。

Notch抑制剂DAPT体外改善L02细胞脂肪变研究

目的探讨Notch抑制剂(DAPT)体外对脂肪变肝细胞细胞炎症因子及脂质相关基因水平的影响。方法采用棕榈酸(PA)干预体外构建肝细胞脂肪变模型,采用不同浓度的DAPT干预。采用CCK-8检测细胞存活率,采用尼罗红染色了解细胞脂滴量,采用RT-qPCR法检测TNF-α、IL-1β和IL-6和脂肪相关因子【固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)、FASN和ACACA】mRNA水平,采用Western blot法检测细胞p65和SREBP1c蛋白表达。结果在无PA干预的L02细胞,经1μM、2μM、5μM和10μM DAPT处理细胞24 h,细胞存活率均较对照组显著下降(分别为85.2±5.3%、84.6±2.9%、84.4±6.0%和84.5±3.2%对100.0%,P均<0.05);经2μM和5μM浓度的DAPT干预,细胞TNF-αmRNA水平分别为(0.6±0.01)和(0.5±0.1),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.01】,IL-1β水平分别为(0.7±0.2)和(0.4±0.0),显著低于对照组【(1.1±0.1),P<0.01】,IL-6水平分别为(0.8±0.1)和(0.6±0.1),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.05】,细胞p65蛋白表达量也显著降低(P<0.05);2μM、5μM和10μM DAPT处理细胞脂滴荧光强度较对照组显著减弱【分别为(0.2±0.1)、(0.3±0.0)和(0.1±0.0)对(0.7±0.0),P均<0.001】,2μM和5μM DAPT处理细胞FASN mRNA水平分别为(0.7±0.0)和(0.4±0.1),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.001】、ACACA mRNA水平分别为(0.6±0.1)和(0.3±0.0),显著低于对照组【(1.0±0.0),P<0.001】;5μM DAPT处理细胞SREBP1c蛋白表达量显著低于对照组(P<0.01)。结论DAPT能有效降低体外脂肪变细胞炎症因子表达量,缓解细胞内脂滴形成,其机制可能与调控脂肪相关因子的表达有关,提示抑制Notch信号通路有改善细胞脂肪变发生和进展的潜力。

田蓟苷对大鼠A7R5血管平滑肌细胞增殖、迁移、表型转化及Notch1信号通路调控的影响

目的 研究田蓟苷对A7R5血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化的影响及其抗动脉粥样硬化(AS)的可能作用机制。方法 采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激A7R5细胞建立血管平滑肌表型转化模型,将细胞分为正常组、模型组、田蓟苷组、Notch1通路抑制剂组(DAPT组)和辛伐他汀组。采用CCK8法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移情况,实时荧光定量PCR法检测细胞SM22α、α-SMA、Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA表达,Western blot法检测细胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1蛋白表达。结果 与模型组比较,各给药组均可抑制A7R5细胞的异常增殖和迁移(P<0.05,P<0.01),上调α-SMA mRNA表达(P<0.01);田蓟苷组和DAPT组下调Notch1通路相关基因Notch1、Hes-1、Hes-5和Jagged-1 mRNA表达(P<0.05,P<0.01);田蓟苷组下调Notch1、Hes-1、RBP-Jκ蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论 田蓟苷通过抑制VSMCs的异常增殖、迁移、表型转化及调控Notch1信号通路,从而保护ox-LDL诱导的A7R5细胞损伤。

白藜芦醇抑制Notch1信号通路对抗小鼠急性T淋巴细胞白血病

目的:观察白藜芦醇(Res)对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)小鼠的影响,并进一步探讨其对Notch1信号通路的作用机制。方法:将25只6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、T-ALL组和Res组,其中Res组又进一步分为low-Res(L-Res)、middle-Res(M-Res)和high-Res(H-Res)3个浓度给药组。应用流式细胞术和瑞氏-吉姆萨染色法检测外周血及脾细胞悬液中白血病细胞百分比,HE染色法观察脾脏和骨髓组织病理形态,RT-q PCR法检测脾脏组织中Notch1、Hes-1、c-Myc、mi R-19b和PTEN m RNA表达水平,Western blot法检测Notch1、Hes-1、c-Myc、p-PTEN和PTEN蛋白表达水平。结果:与对照组相比,T-ALL组小鼠外周血中白血病细胞明显增多,脾脏及骨髓组织中白血病细胞弥漫性浸润,脾脏中Notch1、Hes-1、c-Myc、mi R-19b m RNA表达水平和Notch1、Hes-1、c-Myc蛋白表达水平均明显增高(P<0.01),PTEN m RNA及其蛋白水平显著降低(P<0.01),经白藜芦醇处理后,H-Res组以上各项指标较T-ALL组均获得逆转。结论:白藜芦醇具有抗小鼠T-ALL的作用,其机制可能通过抑制Notch1信号通路发挥作用。

Notch4 mRNA在口咽鳞癌组织中表达变化及其敲降癌细胞株增殖迁移侵袭能力观察

目的 观察Notch4 mRNA在口咽鳞癌组织和细胞株中的表达变化及敲降Notch4 mRNA表达的口咽鳞癌细胞株增殖、迁移和侵袭能力。方法 收集12对口咽鳞癌组织与癌旁组织,采用RT-q PCR法检测癌组织、癌旁组织中Notch4 mRNA。培养口咽鳞癌细胞株Detroit 562、WSU-HN-30及对照细胞株Ha CaT、2BS,检测细胞株中Notch4 mRNA。将人口咽鳞癌细胞株Detroit 562和WSU-HN-30随机分为si-NC组、si-Notch4-1组和si-Notch4-2组,分别转染si-NC双链核苷酸、si-Notch4-1双链核苷酸、si-Notch4-2双链核苷酸,检测各组细胞株中Notch4 mRNA,使用RTCA法观察各组细胞株的增殖能力(CI值),通过Transwell实验观察各组细胞株的侵袭和迁移能力。结果 与癌旁组织相比,口咽鳞癌组织中Notch4 mRNA相对表达量高(P<0.01);在对照细胞株Ha CaT和2BS中Notch4 mRNA相对表达量差异无统计学意义;与对照细胞株Ha CaT相比,口咽鳞癌细胞株Detroit 562、WSU-HN-30中Notch4 mRNA相对表达量高(P均<0.001)。在口咽鳞癌细胞株Detroit 562、WSU-HN-30中,与si-NC组相比,si-Notch4-1和si-Notch4-2组的细胞株增殖、迁移和侵袭能力降低(P均<0.01)。结论 Notch4 mRNA在口咽鳞癌组织和细胞株中均高表达,敲降Notch4 mRNA表达的口咽鳞癌细胞株增殖、迁移和侵袭能力降低。

基于Notch与Wnt/β-catenin通路探讨黄芪甲苷对人成纤维细胞间质转化的作用

目的基于Notch与Wnt/β-catenin通路,探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-Ⅳ)对类风湿关节炎相关间质性肺病(rheumatoid arthritis associated interstitial lung disease,RA-ILD)体外模型的作用机制。方法用Luminex检测法对RA-ILD模型鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子进行检测,筛选出关键细胞因子;共培养人髓系白血病单核细胞(human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1)与正常人肺成纤维细胞(normal human lung fibroblast,NHLF)两种细胞系,加入关键细胞因子模拟RA-ILD体外模型,给予不同干预措施。通过RT-PCR、Western blot、COIP、EdU、ELISA以及双荧光素酶报告基因活性检测方法观察Snail、ZEB-1及E-Cadherin的启动子活性及mRNA表达、Notch通路中的关键蛋白表达、β-catenin的核转位水平、NHLF细胞增殖速率、ColⅠ、ColⅢ及Fibronectin的分泌水平以及β-catenin与NICD、β-catenin与LEF、NICD与CSL的相互作用。结果使用细胞因子处理NHLF细胞后,Snail、ZEB-1的启动子活性及mRNA表达明显增高,Notch通路中的关键蛋白表达水平显著上调,β-catenin的核转位明显增加,EdU阳性细胞明显增加;细胞上清中ColⅠ、ColⅢ及Fibronectin分泌水平显著上调,同时β-catenin与NICD、β-catenin与LEF、NICD与CSL的蛋白结合明显增加;使用Notch抑制剂DAPT和Jagged1 shRNA时结果与上述结论相反;AS-Ⅳ能够通过抑制Jagged1进而下调Notch及β-catenin信号通路的过度活化,抑制β-catenin与NICD、β-catenin与LEF、NICD与CSL的蛋白结合,能够剂量依赖性地抑制Snail及ZEB-1并上调E-Cadherin的启动子活性、mRNA和蛋白表达水平,抑制NHLF细胞的过度增殖及Col I、ColⅢ、Fibronectin的分泌。结论AS-Ⅳ可能通过抑制Notch和Wnt/β-catenin信号通路,抑制NHLF细胞增殖,减少ECM过度沉积,从而减缓RA-ILD肺间质纤维化进展。

蓝莓花青素调控Notch1/Hes-1通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞氧化损伤的影响及机制研究

目的探讨蓝莓花青素(BA)对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞(RGC)氧化损伤的影响及可能的作用机制。方法将50只雄性SD大鼠随机分为正常组(NC组,n=10)和造模组,造模组一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)50 mg/kg,构建糖尿病模型,造模成功后再随机分为糖尿病模型组(DM组)、蓝莓花青素组(BA组)、DAPT组(Notch1通路抑制剂)和蓝莓花青素+DAPT组(BA+DAPT组),每组10只。BA组每天给予20 mg/kg的BA灌胃,DAPT组给予10μmol/L的DAPT干预,BA+DAPT组给予20 mg/kg的BA灌胃+10μmol/L的DAPT干预,NC组和DM组用等量0.9%氯化钠溶液(生理盐水)灌胃,连续8周。于末次给药24 h后,摘取大鼠眼球,用酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒检测各组大鼠视网膜组织中活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠视网膜组织病理变化,并进行RGC计数;用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测量HO-1和iNOS mRNA表达;Western blot法检测Notch1和Hes-1蛋白的表达。结果建模后,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组空腹血糖(FBG)值均大于16.7 mmol/L;经BA干预治疗后,BA组和BA+DAPT组FBG含量明显降低,BA组低于BA+DAPT组(P<0.05)。ELISA结果表明,与NC组比较,DM组视网膜组织中ROS和MDA含量升高,CAT和SOD含量降低(P<0.05);与DM组比较,BA组和BA+DAPT组视网膜组织中ROS和MDA水平下降,CAT和SOD水平显著上升(P<0.05)。光学显微镜观察显示,NC组视网膜结构清晰,细胞形态正常,排列整齐;DM组大鼠RGC层排列紊乱,内、外核层伴随有水肿,出现了空泡现象,视网膜厚度变薄;BA组大鼠视网膜层结构排列较整齐,水肿程度和视网膜厚度较DM组有一定的改善;BA+DAPT组大鼠视网膜组织较DM组有所改善,但视网膜厚度相比BA组还是较薄。RGC计数结果显示,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组RGC数量分别为7.35±1.28、12.05±1.52、5.61±1.72、8.72±1.19,明显低于NC组的16.63±1.54,组间差异有统计学意义(F=88.905,P<0.05)。qRT-PCR结果表明,NC组、DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组大鼠视网膜组织中HO-1水平分别为1.28±0.32、0.68±0.15、1.03±0.19、0.50±0.13和0.73±0.11,iNOS水平分别为0.48±0.08、1.17±0.21、0.89±0.17、1.35±0.15和1.10±0.23,差异均有统计学意义(F=25.192、35.843,P<0.05)。Western blot结果显示,与NC组相比,DM组视网膜组织中Notch1和Hes-1蛋白表达均下调;与DM组比较,BA组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均上调,DAPT组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均下调,BA+DAPT组两蛋白表达低于BA组,组间差异有统计学意义(F=47.626、54.709,P<0.05)。结论BA可以降低糖尿病大鼠FBG,增强其抗氧化应激能力,改善视网膜组织病理学损伤,从而对神经节细胞起到保护作用,其作用机制可能与激活Notch1/Hes-1信号通路有关。

外周血单个核细胞Notch1水平与稳定性心绞痛患者侧支循环形成的关系

目的:探讨外周血单个核细胞Notch1水平与稳定性心绞痛(SAP)患者冠状动脉侧支循环(CCC)形成的关系。方法:选择2018~2019年在广州市第一人民医院心内科住院的SAP患者100例,患者均接受冠状动脉造影检查并证实左前降支、回旋支、右冠状动脉至少1支血管存在≥90%狭窄。根据Rentrop分级将入选患者分为CCC良好组(Rentrop分级2~3级)56例和CCC不良组(Rentrop分级0~1级)44例,并选择同期门诊进行健康体检的50例健康人群作为对照组。检测患者外周血单个核细胞Notch1水平及血清血管内皮生长因子(VEGF)的水平,分析Notch1,VEGF水平与患者CCC的关系及Notch1与VEGF的相关性。结果:CCC良好组SAP患者外周血单个核细胞Notch1相对表达量[(5.92±0.91)]、血清VEGF水平[(342.47±60.53)ng/L]显著高于CCC不良组[(4.82±0.92)、(273.75±61.44)ng/L]及对照组[(3.92±0.78)(257.32±52.63)ng/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。CCC良好组患者外周血单个核细胞Notch1水平与血清VEGF水平呈正相关(r=0.637,P<0.05);CCC不良组患者中两者无显著相关性(r=0.201,P>0.05)。多因素Logistic回归分析外周血单个核细胞Notch1与血清VEGF水平均是SAP患者CCC良好的独立预测因素(P<0.05)。结论:SAP患者外周血单个核细胞Notch1水平及血清VEGF水平与患者CCC形成良好相关,Notch1信号通路调控VEGF表达可能是影响患者CCC形成的重要机制之一。

基于Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路调控巨噬细胞极化探讨复方雷公藤制剂改善关节炎症的机制

目的基于Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路调控巨噬细胞极化探讨复方雷公藤制剂对佐剂关节炎大鼠关节炎症的影响。方法将30只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组,每组6只,除正常组外,其余组大鼠构建佐剂关节炎模型。致炎后第19天开始,复方雷公藤组给予340 mg/L复方雷公藤制剂混悬液灌胃,每天1次;甲氨蝶呤组给予0.95 mg/L甲氨蝶呤混悬液灌胃,每周1次;Notch1抑制剂组给予0.56 mg/L Notch1抑制剂混悬液尾静脉注射,隔天1次;正常组及模型组给予生理盐水灌胃,每天1次。各组均连续干预30 d。检测各组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数;末次灌胃结束后,HE染色观察关节滑膜组织病理学形态,ELISA法检测血清IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α水平,流式细胞术检测外周血炎症极化标志物CD86、CD206表达情况,免疫组化及免疫印迹法检测关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数、外周血CD86表达占比及血清IL-1β、TNF-α水平和关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达占比均明显升高(P均<0.05),外周血CD206表达占比及血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数(除Notch1抑制剂组)、外周血CD86表达占比及血清IL-1β、TNF-α水平和关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达占比均明显降低(P均<0.05),外周血CD206表达占比及血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显升高(P均<0.05)。结论复方雷公藤制剂可有效减轻佐剂关节炎大鼠关节炎症反应,其机制可能与抑制Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路轴调控巨噬细胞极化,抑制促炎细胞因子的分泌有关。

miR-10b通过激活KLF4/Notch-1/STAT3信号途径加速腹主动脉瘤的进展

目的:miR-10b促进动脉瘤的进展但其机制未明确,本实验通过检测miR-10b对KLF4/Notch-1/STAT3途径的影响阐明其机理。方法:双荧光素酶实验验证miR-10b的靶基因。取20只apoE-/-小鼠构建腹主动脉瘤模型,其中10只尾静脉注射miR-10b过表达的慢病毒,分别记为模型组和miR-10b组。另取10只apoE-/-小鼠作为假手术组,28 d后解剖小鼠腹主动脉行病理学染色、Western-blot实验。将血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用后的THP-1巨噬细胞根据是否转染miR-10b mimic及其Nc对照、是否添加抑制剂分组:(1)Nc组;(2)miR-10b mimic组;(3)Nc+KLF4抑制组;(4)miR-10b mimic+KLF4抑制组;(5)Nc+Notch-1抑制组;(6)miR-10b mimic+Notch-1抑制组;(7)Nc+STAT3抑制组;(8)miR-10b mimic+STAT3抑制组,检测细胞内蛋白水平。结果:检测双荧光素酶活性得知miR-10b可靶向作用于基因KLF4。小鼠血管病理实验发现,与正常小鼠相比,动脉瘤模型小鼠的血管明显增粗、组织结构异常,miR-10b可加重血管病变;CD68+巨噬细胞、蛋白Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9在假手术组、模型组与miR-10b逐渐增多,而α-SMA、蛋白KLF4逐渐减少。(1)、(2)两组细胞间,后者KLF4表达较少、而Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9表达显著偏多;KLF4抑制剂抑制KLF4表达,而Notch-1显著增多;Notch-1被抑制而减少表达,p-STAT3也随之减少;p-STAT3被抑制表达,MMP-2与MMP-9表达量也明显降低。结论:miR-10b通过作用于KLF4/Notch-1/STAT3信号途径,引起动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9表达增加,从而加速动脉瘤的进程。