高压超短电场脉冲高选择性兔下腔静脉血管平滑肌细胞消融模型建立的探索

目的高压超短电场脉冲通过瞬时、高能的局部电场变化,具有不破坏细胞完整结构、诱导细胞自主凋亡的生物学效应,这在抑制血管重构、管壁增生、血管狭窄方面具有潜在的应用价值。本研究自主研发出一款新型高压超短电场脉冲系统,探究该系统对兔下腔静脉作用后的生物学效应。方法利用1000 V/cm、1 Hz高压超短电场脉冲电刺激实验兔下腔静脉60次,常规饲养后,在术后第3天处死后,解剖分离实验兔下腔静脉血管标本,送HE病理染色常规检查。结果成功制备自主研发新型高压超短电场脉冲系统,高压超短电场脉冲作用点区域平滑肌凋亡,血管壁变薄,局部血管内皮细胞无明显损伤;无电刺激对照区域血管内皮细胞、平滑肌细胞及血管壁结构完整。结论高压超短电场脉冲,具有高选择性消融平滑肌细胞,保持周围血管内皮及平滑肌细胞、组织结构完整性的作用。

细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用

为了研究细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用,将脉冲电场参数组合(电场强度10kV/cm,脉宽500ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于细胞骨架裂解的Hep-G2细胞。利用Annexin-V和碘化丙碇(propidium i-odide,PI)双染法检测细胞凋亡和坏死情况;采用荧光分光光度计观测线粒体跨膜电位和细胞膜穿孔的变化情况。试验发现:肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞凋亡和坏死大大降低(与单独脉冲处理组相比检验水平P<0.05),早期细胞凋亡由(16.94±2.87)%下降到(4.77±1.87)%;晚期凋亡和坏死由(20.94±3.09)%下降到(14.38±2.60)%;脉冲处理组和肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞线粒体跨膜电位都出现下降,但后者的线粒体跨膜电位却明显高于前者(P<0.05);单独脉冲处理组和细胞骨架缺失后脉冲处理组二者在相同时间点时其PI荧光强度无明显差异,且PI荧光随时间而变化的规律亦相似。上述结果表明:细胞骨架的缺失抑制了ns脉冲诱导细胞凋亡的线粒体通路,进而降低细胞凋亡水平,但对细胞膜的穿孔情况无明显影响。

纳秒脉冲电场治疗裸鼠皮下人恶性黑色素瘤模型的长期效应

为研究ns脉冲电场(nsPEF)对在体肿瘤的长期杀伤效应,以接种人恶性黑色素瘤A375细胞的BALB/c裸鼠为研究对象,采用电压幅值为4kV、脉冲宽度为200ns、重复频率为1Hz的ns脉冲电场进行治疗。肉眼观察结果表明,瘤体随时间推移而逐渐消褪直至消失,且皮肤恢复完好,原位瘤在平均2周时间内完全消失;瘤体生长抑制情况检测结果表明,与对照组相比,治疗组裸鼠肿瘤体积明显缩小(检验水准P<0.05),随着生存时间延长,对照组和治疗组肿瘤生长速度差别增大;荷瘤裸鼠的存活率-时间关系研究结果表明,ns脉冲电场治疗后26d时间内,对照组裸鼠全部死亡,而治疗组裸鼠存活率高达100%。实验结果表明ns脉冲电场能有效抑制肿瘤组织的生长,并可大大提高荷瘤BALB/c裸鼠的长期存活率。

纳秒脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的内质网信号通路分析

ns脉冲电场在诱导肿瘤细胞凋亡方面展现出诱人的应用前景。由于ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚未明确,严重阻碍了ns脉冲电场肿瘤治疗的临床进程。为进一步揭示其诱导凋亡的机制,将参数组合(电压幅值9kV,脉宽100ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于人卵巢浆液性囊腺癌(SKOV3)细胞。首先检测了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine aspartic acid specific protease-12,Caspase-12)蛋白的释放水平,其次用浓度分别为0、25、50、100μmol/L的钙螯合剂(BAPTA-AM)螯合细胞内的游离Ca2+,用Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡率,最后采用蛋白质印迹(western blot)技术检测了Caspase-12蛋白释放的变化。试验结果表明:ns脉冲诱导SK-OV3凋亡时引起了细胞内Ca2+升高,从而介导内质网凋亡信号通路。该研究结果将进一步揭示ns脉冲诱导凋亡的机制。

纳秒脉冲处理A375细胞裸鼠皮下移植瘤的疗效评估

ns脉冲电场可以诱发肿瘤细胞的结构和功能发生一系列变化,使其在临床肿瘤治疗中展现出巨大的应用前景。目前,受限于检测评估手段,相关动物实验研究尚不充分。将ns脉冲(电场强度20kV/cm、脉宽200ns、重复频率5Hz、2 000个脉冲)作用于A375裸鼠皮下移植瘤,采用荧光活体成像方法定量研究ns脉冲的抑瘤效果,同时用相机随访观察局部疤痕的转归情况。与对照组荧光增加相比,处理组荧光强度逐渐减弱(检验水准P<0.05),且在第2次处理后14d荧光完全消失;随着时间的推移,治疗区域局部疤痕逐渐变浅,并在第2次处理后22d完全消失。实验结果表明,ns脉冲可以实现局部肿瘤组织的完全切除,且能实现皮肤疤痕的有效转归。

基于现场可编程门阵列的全固态高压ns脉冲发生器

为研究ns脉冲电场诱导肿瘤细胞的凋亡效应,结合Marx发生器原理和全固态开关技术,研制了一套基于现场可编程门阵列（FPGA）的多参数可调全固态高压ns脉冲发生器。该发生器主要包括高压直流电源、Marx电路、FPGA控制电路和负载4部分。Marx电路采用金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）作为控制开关代替传统的火花间隙开关,用二极管代替电阻。FPGA产生多路同步触发脉冲信号,通过光纤进行隔离后可作为MOSFET的原始控制信号,同步驱动多个MOSFET。FPGA控制电路控制充电电压和输出脉冲的宽度、频率,并具有保护功能。实验结果表明,该脉冲发生器可产生幅值（0～8kV）连续可调、脉宽（200～1 000ns）灵活可变、频率（1～1 000Hz）独立可控,前沿35ns的高压ns脉冲,为进一步探索ns脉冲电场生物医学效应奠定了基础。

高压纳秒脉冲电场消融黑色素瘤细胞实验研究

为了研究高压纳秒脉冲电场(nsPEF)消融恶性肿瘤的关键影响参数,基于火花开关和传输线变压器(TLT)技术,自主研制重频高压纳秒脉冲电场(RnsPEF)发生系统,可以稳定输出纳秒级脉宽的指数脉冲,证实了高压纳秒脉冲电场杀伤肿瘤细胞的效果和可控性.以贴壁生长于六孔板中B16黑色素瘤细胞为对象,研究脉冲次数、峰值电压、重复频率和电极针对间距对肿瘤细胞消融效果的影响.以电极杯中B16肿瘤细胞悬液为研究对象,结合CCK-8检测法开展脉冲处理后细胞活性的研究.结果发现,高压脉冲电场和脉冲能量注入密度是影响纳秒脉冲电场消融肿瘤细胞的关键因素,重复频率对消融效果的影响不大.结果显示,自制RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞的阈值电场强度为6.8 kV/cm,注入能量密度的阈值为11.4 J/cm3和最佳消融次数为500次脉冲.

PEF中脉冲上升沿对金黄色葡萄球菌杀菌的影响

方波脉冲因能量集中、能量利用率高、杀菌效果好而被认为是PEF技术的最优选择。但关于其上升时间对杀菌效果影响的研究和报道都比较少。为此,研究了在脉冲电场(PEF)技术中,高压方波脉冲的上升前沿对金黄色葡萄球菌杀菌效果的影响。通过实验分别比较了在上升时间为2μs和200ns的高压方波脉冲作用下,3种不同电导率(1.5、2.0、2.5mS/cm)的苹果汁在有效处理时间75μs、电场强度分别为25、30、35kV/cm下对金葡菌的杀灭效果。实验结果表明:在处理时间和脉冲电场强度等其它因素都相同的条件下,陡前沿的方波脉冲电场比上升时间长的方波脉冲电场对金葡菌的杀灭效果更好,平均能提高0.5个对数;处理后的温升也要低1～6°C。

裸鼠皮下人恶性黑色素瘤在纳秒脉冲电场下的凋亡机制

为研究ns脉冲电场(nsPEF)治疗在体肿瘤的生物电效应机制,以接种人黑色素瘤细胞A375的BALB/c裸鼠为研究对象,采用电压幅值为4kV、脉冲宽度为200ns、重复频率为1Hz的脉冲电场进行处理。用凝胶电泳法检测脉冲处理后的DNA Ladder分布情况表明,与对照组相比,处理组有明显阶梯状分布,即细胞发生凋亡。用TUNEL法检测肿瘤组织的凋亡情况表明,处理组表现出较高凋亡率(检验水准P<0.01)。用Western blot法和免疫组织化学方法检测脉冲处理后肿瘤组织中促凋亡蛋白Bax、凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量情况,2者共同表明,与对照组相比,处理组Bax表达量显著升高(P<0.01),而Bcl-2表达量明显降低(P<0.01)。实验结果揭示nsPEF通过Bax、Bcl-2基因调控作用来诱导肿瘤凋亡。

纳秒级电场脉冲诱导肿瘤细胞凋亡的线粒体通路研究

将纳秒级电场脉冲作用于人卵巢癌(SKOV3)细胞,通过流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)、线粒体跨膜电位(MTMP)的变化情况,用免疫荧光法检测线粒体膜间隙凋亡相关蛋白释放情况;用Western blot法检测线粒体膜间隙凋亡相关蛋白表达及活化情况,以研究纳秒级电场脉冲诱导肿瘤细胞凋亡的线粒体通路。实验发现:经纳秒级电场脉冲处理后,细胞活性氧即刻升高,且线粒体跨膜电位在6 h时达到最低值;线粒体膜间隙蛋白释放入胞浆(P<0.05);线粒体凋亡通路相关蛋白表达量也明显升高(P<0.05)。结果表明,在纳秒级电场脉冲诱导的肿瘤细胞凋亡中,线粒体凋亡通路参与并发挥了重要作用。

高频纳秒脉冲电场作用下多细胞系统穿孔特性仿真

为了研究高频纳秒脉冲电场(ns PEFs)杀伤肿瘤细胞的机理,结合笛卡尔传输网格(CTL)和动态电穿孔等效电路模型对1个典型的2维多细胞系统在ns PEFs作用下的穿孔特性进行了仿真。利用Pspice仿真软件建立了该多细胞系统电路模型,并分析了其穿孔数量和穿孔半径变化特性。首先施加了10个场强、频率和脉宽分别为5k V/cm、1 MHz和500 ns的高频纳秒脉冲到该多细胞系统模型,结果表明随脉冲个数增加穿孔区域分布变化不大,而穿孔半径分布有明显的累积效应,细胞外膜和细胞核膜上部分孔的半径逐渐增大。同时比较了电场强度为3、5和10 k V/cm时该系统中穿孔数量和最大孔径随脉冲个数增加的变化情况。结果显示场强增加时穿孔数量明显增加,特别是场强从3 k V/cm提高到10 k V/cm时,系统整个细胞核膜从未穿孔到穿孔数量增加到2.658 4×105个。另外,穿孔半径仍然存在累积效应。仿真结果说明适当参数的高频ns PEFs能使细胞核膜发生穿孔,并起到扩大细胞部分穿孔半径的作用,可为后续实验研究选择高频纳秒脉冲参数提供依据。

纳秒脉冲诱导SKOV3细胞凋亡的死亡受体途径分析

ns脉冲电场独特的诱导肿瘤细胞凋亡的生物电效应,引起了相关学者广泛的关注。为此,结合最新研究成果,侧重于ns脉冲对细胞膜结构和功能的影响,重点研究ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的死亡受体途径。将优化的脉冲电场参数组合(电压幅值为9kV,脉宽为100ns,脉冲为30个,频率为1Hz)作用于人卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3。利用流式细胞术和凝胶电泳法检测细胞凋亡、坏死情况;逆转录聚合酶链式扩增反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8,Caspase-8)和Bid的信使核糖核酸(messager ribonucleic acid,mRNA)释放水平;蛋白质印迹(western blot)法检测Fas、FasL、Caspase-8和Bid蛋白释放水平。实验结果表明:ns脉冲诱导SKOV3凋亡时引起了Fas、FasL、Caspase-8和Bid等释放水平的升高,从而诱导死亡受体凋亡信号通路。该研究结果大大拓展了ns脉冲诱导凋亡的机制研究,从而为临床肿瘤治疗提供理论支撑。

ns脉冲电场发生器的研制及应用

为了研究ns脉冲电场诱导肿瘤细胞的凋亡效应,结合开关电源技术和脉冲功率技术,研制了一套多参数大范围独立可调的ns脉冲电场发生器。该发生器由高压直流电源、脉冲形成电路和辅助电路3部分组成,输出的脉冲幅值0～1.2kV内连续可调,重复频率1Hz～10kHz内连续可调,脉冲宽度分100、200、600和1000ns4级可调,脉冲个数可以任意预置,上升时间<30ns,并具有显示和保护功能。实验室调试和医学细胞实验结果表明,该发生器调节方便、性能稳定,能够有效诱导人肝癌细胞凋亡,为ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的机理和阈值参数选择规律的深入研究奠定了基础。

纳秒脉冲用于细胞内电处理的研究进展

近年来,国内外学者对纳秒脉冲电场应用于细胞内电处理效应进行了一些较为深入的实验和机制研究,实验结果表明纳秒脉冲电场不会导致细胞膜电穿孔,但能够诱导凋亡、钙离子释放、基因表达增强、DNA和染色体破碎等细胞内电处理效应。为了解释细胞内电处理,研究者们认为当脉冲电场的脉宽大于细胞膜充电时间常数时,脉冲电场主要作用在细胞外膜上产生电穿孔。随脉冲宽度变小,电场对细胞核及核膜影响增强,当脉宽小于细胞膜充电时间常数时,脉冲电场主要作用于膜内细胞器,进行细胞内电处理。

ns脉冲电场诱导裸小鼠皮下人黑色素移植瘤凋亡

为研究ns脉冲电场对在体肿瘤的诱导凋亡效应,以接种人黑色素瘤细胞A375的BALB/c裸小鼠为对象,采用电场强度20kV/cm、脉冲宽度300ns的脉冲电场处理后,抑瘤效应宏观观察到肿瘤组织的生长受到显著抑制(P<0.01),透射电子显微镜观察到典型的凋亡细胞超微结构形态,免疫荧光染色法定性检测到caspase-3蛋白表达明显增强,用RT-PCR方法定量检测到caspase-3 mRNA表达明显增强(P<0.01)。实验结果证实了ns脉冲电场能有效抑制在体肿瘤组织生长,机制在于其通过活化肿瘤细胞caspase-3蛋白酶而诱导肿瘤细胞调亡,为ns脉冲电场治疗肿瘤提供了依据。

纳秒脉冲诱导肿瘤细胞缝隙连接通讯恢复的实验研究

将纳秒脉冲作用于人肝癌细胞(Hep-G2),通过荧光漂白恢复(FRAP)技术,检测荧光萃灭后肿瘤细胞的荧光强度变化情况,以研究纳秒脉冲对肿瘤细胞缝隙连接通讯(GJIC)功能变化的影响。经纳秒脉冲处理后,与对照组相比,处理组荧光恢复率显著增加,且随着时间的推移,所有处理组的荧光恢复率都达到对照组的3倍以上。此外,处理组肿瘤细胞的荧光漂白恢复率随脉冲个数的增加而升高。实验结果表明,纳秒脉冲促进了肿瘤细胞缝隙连接通讯功能的恢复,且在固定的脉冲宽度和幅值下,GJIC对纳秒脉冲作用的响应程度与施加的脉冲个数呈正相关。研究结果不仅为纳秒脉冲用于GJIC障碍性疾病的治疗提供了一条全新的途径,而且也深化了纳秒脉冲诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究。

细胞内电处理用ns脉冲发生器研究进展

为了便于全面了解目前细胞内电处理实验研究的方法和具体实施方案,综述了国内外用于细胞内电处理实验研究的ns脉冲发生器。从电容器充放电和传输线理论2方面介绍了这些发生器产生ns级、高强脉冲电场的工作原理;分析了用于细胞内电处理的ns脉冲发生器性能特点、发生器的电路结构、元器件选择和技术指标等。实验结果表明,这些发生器产生的ns脉冲电场能诱导细胞内电处理效应。对今后的研究工作进行了讨论和展望。

纳秒脉冲电场消融乳腺癌的实验研究

目的探索纳秒脉冲对乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231的治疗效果及其分子机制。方法纳秒脉冲电消融乳腺癌细胞及荷瘤小鼠后,检测接受纳秒脉冲治疗(实验组)及未接受纳秒脉冲治疗(对照组)的小鼠肿瘤细胞增殖、周期和凋亡相关指标,观察肿瘤的体积、生长形态及速度等的变化。结果纳秒脉冲在体外可以显著降低细胞活性,诱导细胞凋亡,表现为实验组CCK-8细胞活性抑制率与对照组比较,差异有高度统计学意义(P<0.01),且各实验组间差异均有高度统计学意义(P<0.01);投射电镜和线粒体电势实验观察到细胞出现凋亡,抑制肿瘤生长。结论纳秒脉冲可以通过诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡而对肿瘤进行消融。

亚纳秒脉冲电场联合温度杀伤人宫颈癌细胞的实验研究

为研究亚纳秒脉冲联合温度对人宫颈癌(He La)细胞的杀伤效应,将脉冲电场参数组合(电场强度25、50、100 k V/cm,半峰值脉宽1 ns,脉冲个数分别为4000、1000、250,频率5 Hz),作用于处于不同温度(25℃、43℃、48℃)的He La细胞,利用MTT检测亚纳秒脉冲对细胞的生长抑制情况,通过AO/EB染色和透射电镜观察细胞形态学变化,采用免疫细胞化学S-P法检测caspase-3蛋白表达活性。实验发现:当细胞悬液温度到达48℃后,随着时间推移细胞死亡率不断增加;采用亚纳秒脉冲电场(电场强度50 k V/cm,半峰值脉宽1 ns,脉冲个数1000,频率5 Hz)处理不同温度下He La细胞,细胞悬液温度达到43℃后,细胞死亡率达到18.07%±1.98%,细胞悬液温度达到48℃,细胞死亡率增至25.11%±6.05%;采用相同能量脉冲电场处理处于相同温度(48℃)的细胞悬液时,细胞死亡率与脉冲场强正相关,100 k V/cm电场作用下得到最高细胞死亡率为31.09%±5.03%,进一步的分子生物学检测结果显示He La细胞发生凋亡效应。适当场强的亚纳秒脉冲联合温度通过诱导细胞凋亡,进而杀死He La细胞。

纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞凋亡及对Fas介导的细胞凋亡通路的影响

为探讨纳秒级陡脉冲(nsPEFs)对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡作用及Fas介导的细胞凋亡通路的影响,以场强为45kV/cm,脉宽分别为50、100和200ns,脉冲个数为30个的nsPEF处理的SKOV3细胞为实验组,以未经处理的SKOV3细胞为对照组,流式细胞术检测细胞晚期凋亡率和(或)死亡率,琼脂糖凝胶电泳法检测DNA Ladder,RT-PCR和Western blot检测细胞内Fas、FasL、caspase-8和Bid的表达量变化。结果显示与对照组相比,脉宽分别为50、100和200ns组细胞晚期凋亡率和(或)死亡率分别为(18.31%±0.65%)、(45.55%±3.71%)和(47.47%±7.01%),明显高于对照组(3.03%±0.57%)(P<0.05);琼脂糖凝胶电泳结果显示脉宽为50ns和100ns组有大量DNA ladder形成,而200ns组条带模糊;RT-PCR检测结果显示50ns、100ns组Fas、FasL、caspase-8和Bid mR-NA表达量均显著升高(P<0.05),200ns组mRNA表达量均显著降低(P<0.05);Western blot检测结果显示50ns、100ns组Fas、FasL、caspase-8和Bid蛋白表达量显著升高(P<0.05),200ns组蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。提示场强45kV/cm,脉宽为50ns、100ns的nsPEFs能诱导人卵巢癌SKOV3细胞发生凋亡,机理可能与Fas介导的细胞凋亡通路被激活有关。