PRRSV Nsp4基因突变株对β2M表达的影响

[目的]本试验旨在探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp4基因是否在抑制细胞β2M表达方面发挥关键性作用,以进一步研究PRRSV对抗原递呈的免疫抑制机制。[方法]建立PRRSV的反向遗传平台并成功拯救出PRRSV野生毒株SH2020。根据之前对Nsp4基因不同结构域的研究以及氨基酸位点功能预测,在其DomainⅡ和DomainⅢ分别筛选出3个和5个不同的氨基酸位点,并在病毒感染性克隆质粒上对这些位点进行不同的氨基酸替换突变,再将构建好的感染性克隆质粒转染Marc-145细胞以拯救各个Nsp4突变PRRSV病毒,将拯救的PRRSV病毒以MOI=0.02感染PAM细胞,并通过RT-qPCR和Western blot验证PRRSV Nsp4基因是否能够在PAM细胞β2M表达方面发挥作用。[结果]成功拯救出PRRSV D2-5(Nsp4-A80L)突变毒株,并且在Marc-145细胞上的生长动力学特性与野生毒株SH2020相似;而Nsp4基因其余位点突变则会导致PRRSV生长受到显著抑制从而无法进行试验。Western blot和RT-qPCR试验结果证实PRRSV D2-5毒株能够显著促进β2M在Marc-145和PAM细胞的表达,而野生毒株SH2020则表现出了对β2M表达的抑制作用。[结论]Nsp4基因在PRRSV抑制细胞β2M表达方面发挥重要作用,并且Nsp4-A80L突变能够显著促进β2M的表达。

轮状病毒NSP4胞质区在杆状病毒系统的表达及其黏膜佐剂效应评价

目的:应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达轮状病毒(RV)非结构蛋白NSP4的胞质区(CF)片段(47~175 aa),并初步检测其黏膜免疫佐剂效应。方法:将RV NSP4-CF基因片段定向克隆至转座载体pFastBac1,转化DH10Bac并筛选重组杆粒Bac-NSP4-CF。脂质体介导Bac-NSP4-CF转染sf9细胞,收获细胞并传代培养。测定病毒滴度,Western blot检测目的蛋白表达情况。纯化后的重组NSP4-CF与卵清蛋白(OVA)滴鼻共免疫小鼠,并检测其黏膜免疫佐剂效应。结果:在杆状病毒系统中成功获取了NSP4-CF重组蛋白,Western blot检测可见约16 kD的特异性条带;重组NSP4-CF与OVA共免疫小鼠后,小鼠血清OVA特异性IgG、IgA抗体水平与肠道SIgA水平较OVA单独免疫组均有升高(P<0.05);ELISPOT检测结果表明NSP4-CF佐剂组(5μg)分泌IFN-γ的脾细胞平均数均高于OVA组(P<0.05)。结论:经昆虫细胞表达系统可获得RV NSP4胞质区(47~175 aa)重组蛋白,该蛋白与模式抗原经黏膜途径免疫小鼠具有增强系统免疫应答与黏膜免疫应答的佐剂活性,为进一步研究RV-NSP4佐剂活性区域及其分子机制提供了实验基础。

禽传染性支气管炎病毒nsp4蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒(IBV)非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体,为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础,也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株nsp4蛋白进行原核表达,以融合蛋白nsp4作为免疫原免疫健康日本大耳白兔和健康阴性鸡,制备相应的兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体,并通过间接ELISA检测、Western blotting检测及IFA验证等对制备获得的多克隆抗体进行生物学功能研究。【结果】选取nsp4蛋白第408~514位氨基酸作为原核表达序列,成功构建了nsp4蛋白原核表达载体pCZN-1-HIS-nsp4和nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA。原核表达的融合蛋白nsp4为13.6 kD,与预期结果相符,能与IBV GX-YL5株和M41株全病毒阳性血清反应。制备的兔、鸡多克隆抗体血清效价分别为1∶128000和1∶6400,均能与融合蛋白nsp4和IBV全病毒反应,且与IBV GX-YL5株、Beaudette株和M41株感染鸡胚肾细胞(CEK)表达的nsp4蛋白反应,还能与转染状态及感染IBV Beaudette株的非洲绿猴肾细胞(Vero)表达nsp4蛋白反应。实时荧光定量PCR检测结果表明,经nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA转染后,Vero细胞的病毒载量呈逐渐上升趋势,即体外过表达nsp4蛋白能促进IBV的复制。【结论】制备获得的2种IBV nsp4多克隆抗体效价高、反应性良好、特异性强,可作为细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析nsp4蛋白在IBV增殖过程中的作用机制,也为其他冠状病毒nsp4蛋白的研究提供参考。

G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征

最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。

人轮状病毒NSP4基因变异与功能关系的初步研究

在比较我国人A组轮状病毒一般腹泻患者分离株和重症患者分离株非结构蛋白 (NSP) 4cDNA序列时发现 ,两者在可能与致病性有关的区域 (aa131～ 14 6 )内存在着显著的差异。为进一步探讨这种变异是否与毒力改变有关 ,利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞Sf9中表达两种毒株的NSP4 ,通过激光扫描共聚焦显微镜初步观察了它对细胞内钙离子浓度的影响。结果表明 :两种来源的NSP4均可使细胞内钙离子浓度明显升高 ,在 4 8h时大致升高3.1～ 3.4倍 ,96h时升高 5 .6～ 5 .8倍 ,但两种毒株之间的差别并不明显。研究证实 ,人轮状病毒NSP4与以往报道的动物轮状病毒NSP4一样 ,可以引起细胞内钙离子增高 ,即可能与病毒的致病性有关。但重症腹泻毒株SZ1NSP4第 131～ 14 6位氨基酸位点出现的变异并未提高其毒力。轮状病毒的毒力改变可能与其它因素有关。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4切割IKKα抑制β干扰素产生的研究

IKK复合体由IKKα、IKKβ和IKKγ3个亚基组成。早期研究结果表明催化亚基IKKα在调节β干扰素(IFNβ)产生方面发挥重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染及其非结构蛋白4(NSP4)表达能够显著抑制宿主的天然免疫反应。本研究结果显示PRRSV NSP4可以与IKKα结合,并能够切割IKKα。而且,丝氨酸蛋白酶活性是PRRSV NSP4切割IKKα所必需的,其中NSP4中的3个蛋白酶活性位点(His^(39)、Asp^(64)和Ser^(118))中任何一个发生突变均无法切割IKKα。进一步研究证明,NSP4通过切割IKKα抑制了NF-κB和IFNβ启动子的活性。本研究结果表明,PRRSV NSP4除了通过切割NEMO和MAVS抑制NF-κB和IFNβ启动子活性以外,也可以通过切割IKKα抑制机体NF-κB的激活和IFNβ的表达。这些研究结果为阐明PRRSV逃逸宿主天然免疫提供了一个新的证据,为深入研究PRRSV的致病机理奠定了基础。

轮状病毒NSP4基因在非复制型腺病毒载体中的表达及免疫活性

目的:研究以非复制型重组腺病毒表达人轮状病毒NSP4基因作为新型轮状病毒基因疫苗的可行性．方法:用AdEasy系统构建表达NSP4蛋白的重组腺病毒,并通过形态学观察、PCR、RT- PCR、Southern blot和Western blot等对重组腺病毒进行鉴定．通过滴鼻途径免疫♀小鼠,对免疫后母鼠生产的乳鼠(4日龄)用SA11株轮状病毒灌胃攻击,观察腹泻的产生情况并进行腹泻评级．结果:获得了重组腺病毒rvAdEasyNSP4． Southern blot表明,在重组腺病毒中确有特异性的NSP4基因整合,Western blot证明,目的蛋白得到表达．初次免疫小鼠后血清IgG抗体的滴度可达1:1 000,但阳转率仅为28．5％;再次免疫后,血清抗体阳转率达到了85．7％;第3次免疫后,血清抗体阳转率达到100%．血清IgA 阳转率可以达到71．4％．实验组乳鼠攻毒后腹泻的百分率和腹泻评分(反应腹泻严重程度) 均较对照组低．结论:腺病毒载体可有效表达轮状病毒非结构蛋白NSP4并可有效诱导小鼠免疫反应,这些结果的取得为新型轮状病毒疫苗的研制提供了依据．

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4切割天然免疫分子NEMO抑制I型干扰素的产生

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵入宿主细胞后能够强烈抑制宿主天然免疫反应。早期研究表明,PRRSV 4个非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP4和NSP11均可以抑制I型干扰素(IFN-I)的产生,但NSP4抑制IFN-I的机理尚无相关报道。本研究显示PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)导致宿主蛋白NEMO(NF-κB essential modulator)被切割,产生一条约40 ku的蛋白条带。通过检测PRRSV编码蛋白酶的切割功能,进一步表明其NSP4是切割NEMO的关键蛋白酶。免疫共沉淀试验表明NSP4与NEMO具有特异性相互作用;激光共聚焦试验结果表明两者在细胞浆中共定位。通过双荧光素酶报告基因试验显示,NSP4过表达可以显著抑制仙台病毒(SeV)和NEMO诱导的IFNβ启动子的激活,导致IFNβ表达量显著下降(p<0.01)。本研究结果表明,PRRSV NSP4可以切割宿主蛋白NEMO,从而显著抑制IFNβ启动子的激活,从分子水平解释了PRRSV NSP4抑制IFNβ产生的机理。

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用。分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSP4蛋白C端86-175氨基酸并用GlutathioneSepharose^(TM) 4B亲和纯化。将纯化蛋白分别以0.4nmol和1.5nmol的剂量腹腔注射新生Balb/C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况。当注射0.4nmol GST-NSP4_T重组蛋白时,有1只小鼠发生一过性腹泻(1/6),给予1.5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性。本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用。

高致病性PRRSV HuN4株Nsp4的原核表达及其抗体水平检测

为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp4的免疫学特性,本研究根据PRRSV HuN4株序列,设计并合成用于扩增PRRSV HuN4株Nsp4基因的引物。将扩增产物与原核表达载体pGEX-6P-1连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。Western blot试验显示,Nsp4在大肠杆菌中获得较高水平的表达,并且具有良好的反应活性。利用该蛋白建立ELISA方法,检测PRRSV HuN4株感染仔猪的不同时间内的血清,并比较抗Nsp4,囊膜蛋白和M蛋白,N蛋白的抗体水平,结果表明Nsp4抗体升高的时间晚于囊膜蛋白和M蛋白、N蛋白出现的时间,同时抗体水平也低于其他蛋白。

NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

【目的】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus,RV)。【方法】以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93—104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。【结果】成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。

猪轮状病毒NSP4蛋白135、136和138位点氨基酸突变对毒力影响的研究

在比较我国猪轮状病毒(PRV)强弱毒株非结构蛋白NSP4 cDNA序列时发现,两者在可能与致病性有关的区域(aa112～aa175)内存在显著差异。为进一步研究这种变异是否与毒力改变有关,本研究从我国流行弱毒株JL94中扩增Nsp4基因并突变其135、136和138氨基酸位点,以谷胱甘肽S-转移酶GST重组蛋白的形式在大肠杆菌Rosseta中表达突变和未突变两种Nsp4蛋白C端编码aa 112～aa 175的截短蛋白并用Glutathione SepharoseTM4B亲和纯化。将纯化的两种蛋白均以40μg的剂量腹腔接种新生BALB/c乳鼠。结果显示,接种GST-Nsp4突变重组蛋白组,有大部分小鼠先后发生腹泻(7/12),接种未突变GST-Nsp4重组蛋白组,只有少部分小鼠发生先后腹泻(3/12),而注射PBS的对照组,均未发生腹泻。本研究证明PRV Nsp4第135位、136位和138位氨基酸位点的变异影响蛋白毒性的改变,其致腹泻活性具有明显差异(p<0.05)。为进一步研究PRV的致腹泻机理和防制及其疫苗的研制奠定基础。

人轮状病毒NSP4蛋白131和133位氨基酸变异对毒力影响的研究

目的研究两株A组人轮状病毒NSP4蛋白131位和133位氨基酸位点的变异对毒力的影响。方法从昆明地区2002年和2005年秋冬季婴幼儿腹泻流行期不同程度腹泻患儿中分离得到两株轮状病毒流行株02k38和05k44,RT-PCR扩增NSP4全长基因,进行cDNA序列测序。通过pGEX-5X-1载体,转化E.coliBL21以谷胱苷肽S-转移酶融合蛋白的形式表达两株病毒的NSP4蛋白C-端86～170位氨基酸（GST-NSP486-170）;并酶切融合头纯化得到两种NSP486-170蛋白,在ICR乳鼠中比较这两种蛋白致小鼠腹泻的差异。结果两种NSP486-170蛋白毒性无差异。结论两株轮状病毒131位和133位氨基酸位点的变异不影响毒力的改变,其致腹泻活性没有明显差异（P〉0.05）。

轮状病毒肠毒素NSP4:一个多功能糖蛋白

轮状病毒(rotavirus,RV)是在世界范围内造成婴幼儿和幼年动物病毒性腹泻的最主要病原。A组RV的NSP4蛋白被认为是病毒的肠毒素,近年来的研究发现,这个非结构蛋白NSP4在RV致病过程中起着重要的作用。本文简要综述了多功能肠毒素NSP4的研究进展。

我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究

对我国轮状病毒流行株NSP4基因变异特点的分析表明,NSP4基因主要可分为Wa组和Kun组,在Wa组内可形成三个亚组,形成了4种NSP4基因型。为了进一步阐明人轮状病毒流行株NSP4基因变异与其致病性变化是否存在联系,我们首先利用杆状病毒载体对NSP4蛋白进行表达,获得了对应4种不同NSP4基因型的重组杆状病毒rvBac97B6,rvBac97S34,rvBac97S36和rvBac97SZ8。用这些病毒感染Sf9细胞后,检测细胞内Ca2+浓度的变化,发现与野生型杆状病毒感染细胞相比,重组病毒感染细胞内的Ca2+浓度显著升高,但各个重组病毒之间无显著性差异。在此基础上,我们进一步在E.coli中分别表达纯化了代表Wa和Kun基因分组的97S34和97SZ8流行株的NSP4。分别用纯化的重组NSP4蛋白攻击乳鼠后,发现不同基因型的NSP4蛋白的致腹泻活性没有明显差异,这种作用可被NSP4抗体拮抗,但这种拮抗作用存在基因型特异性。上述结果表明人轮状病毒流行株NSP4氨基酸序列间的变异并没有使其钙调节及致腹泻能力产生改变,在致腹泻作用中发挥关键作用(或决定性作用)的氨基酸位点在不同NSP4基因型间可能是相对保守的。针对NSP4抗体的有效性也为新型轮状病毒疫苗和药物研究提供了线索。

轮状病毒LLR疫苗株非结构蛋白NSP4基因稳定性研究

目的研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株NSP4基因的遗传特征及基因稳定性,为疫苗的质量控制提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增NSP4基因片段,将其克隆入质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析。结果 LLR株NSP4基因全长751 bp,含编码175个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的NSP4基因核苷酸与推导的氨基酸序列完全一致,与GenBank中LLR参考株(AY219873)进行比较,核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为99.1%和99.7%,各关键功能区均未发生改变。与27株A～F不同基因群RV代表株进行比较,LLR株与A基因群RV的NSP4同源性较高,核苷酸推导的氨基酸同源性为89.2%～95.5%;与B、C、D、E、F基因群RV核苷酸推导的氨基酸同源性分别为83.5%～87.5%、85.2%～87.5%、65.9%～67.8%、27.6%～30.8%、77.8%;系统发生树显示LLR株与A基因群RV在一个分支内。结论轮状病毒LLR疫苗株在原代牛肾细胞上连续传代NSP4基因遗传特性极其稳定,从分子水平证明LLR疫苗株毒种及其生产的疫苗是安全的。

轮状病毒NSP4与轮状病毒腹泻的相关研究新进展

轮状病毒 (rotavirus ,RV)是婴幼儿腹泻的最主要病原。尽管对其流行病学及防治进行了深入研究 ,但RV腹泻的发病机制尚未阐明。近年来 ,RV非结构蛋白NSP4在病毒致病性中的重要作用得到了一致重视。本文就NSP4蛋白的分子结构及其在RV腹泻发病机制中的作用、NSP4基因变异与RV腹泻临床症状严重程度的相关性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究

为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表达的NSP4蛋白主要分布在细胞核内,HR区是其核定位信号,NSP4蛋白通过HR区信号作用主动进入细胞核内。

轮状病毒非结构蛋白NSP4研究进展

轮状病毒 (rotavirus,RV)是病毒性腹泻的主要病因。NSP4 (nonstructural protein4 )作为轮状病毒的一种非结构蛋白 ,在病毒形态发生和致病性中发挥重要作用 ,近年来日益受到重视。本文就 NSP4的研究进展作一综述。

轮状病毒不同基因型NSP4的免疫原性研究

NSP4作为轮状病毒的致泻相关蛋白,其在疫苗研究中的作用近年来深受瞩目。为比较不同基因型非结构蛋白NSP4的免疫原性,构建了四种基因型的重组表达质粒pCI-9786、pCI- 97S36、pCI-97S34和pCI-97SZ8,在细胞水平进行瞬时表达检测后,进一步免疫小鼠,检测血清IgG 抗体滴度和亚型。结果表明利用真核表达质粒表达的NSP4蛋白既可以诱导体液免疫反应,又可以诱导细胞免疫反应,但以体液免疫为主,不同基因型NSP4具有不同的免疫原性。