基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方15法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10^(1) CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10^(5) CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌nuc基因LAMP检测方法的建立

为了快速鉴定因金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎,采用环介导等温扩增(LAMP)技术和传统PCR技术,针对金黄色葡萄球菌nuc基因设计特异性引物并进行扩增鉴定,同时对两种鉴定方法的最适反应条件、灵敏度和特异性进行了研究。结果显示,LAMP和传统PCR均能成功扩增金黄色葡萄球菌的nuc基因,但通过优化LAMP反应条件,在62℃时对nuc基因呈现最佳扩增效果,与传统PCR鉴定方法相比,LAMP对金黄色葡萄球菌nuc基因最低检测浓度为50 fg/μL,其检测灵敏度是PCR的10~4倍。说明LAMP能精准鉴定因金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎,且针对nuc基因的鉴定操作简单、特异性强、灵敏度高。

Nuc和mecA基因在金黄色葡萄球菌及其甲氧西林耐药性检测中的初步应用

目的为获得金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药信息,评估通过PCR扩增nuc基因、mecA基因检测金黄色葡萄球菌及其甲氧西林耐药性的可行性。方法收集获得63株临床分离鉴定的金黄色葡萄球菌,采用传统药敏检测方法进行菌株药敏测试;再用PCR方法检测菌株是否携带nuc基因和mecA基因,以传统药敏检测结果为参照,评估用PCR扩增技术检测金黄色葡萄球菌及其甲氧西林耐药性的可行性。结果 1.样本菌株中有24株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphyococcus aureus,MRSA),39株为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Methicillin-sensitive Staphyococcus aureus,MSSA)。来自重症医学科的分离株中MRSA数量较多。2.样本菌株nuc基因携带率为85.7%,其中nuc基因在MRSA菌株中的携带率为87.50%,在MSSA菌株中携带率为84.62%;3.样本菌株mecA基因的携带率为19.05%,其中MRSA菌株的mecA基因携带率为50.0%,MSSA中均不携带mecA基因。来自重症医学科的MRSA中同时携带mecA基因和nuc基因的比例为77.78%。结论用PCR技术检测nuc基因、mecA基因来快速鉴定金黄色葡萄球菌及其甲氧西林耐药性可能存在一定比例的误诊结果。

MecA、Nuc基因在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用

目的通过对180株金黄色葡萄球菌临床分离株MecA、Nuc基因的检测,以期选择出一种适合临床的并能简便、快速、准确检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的方法。方法细菌鉴定及药敏采用全自动细菌鉴定和药敏分析仪。MecA、Nuc基因检测采用荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)法。结果 FQ-PCR对180株金黄色葡萄球菌MecA、Nuc基因检出率为75.0%,全自动细菌鉴定和药敏分析仪对180株金黄色葡萄球菌的MRSA检出率为72.8%,2种检测方法比较差异无统计学意义(P>0.05)。全自动细菌鉴定和药敏分析仪对MRSA的检测正确率为94.8%。结论 FQ-PCR检测MRSA正确率高,只需要1~2 h即可完成。该方法快速、简便、准确,值得推广应用。

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的 建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法 将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果 核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论 建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。

高湿地区不同海拔人群鼻腔nuc—mecA基因定植研究

目的：调查高湿地区不同海拔高度世居人群鼻腔内 nuc-mecA基因定植情况，为高原高湿地区金黄色葡萄球菌及甲氧西林耐药病原菌的防治和抗生素的合理使用提供数据。方法收集1000 m，1200 m和1400 m三个不同海拔高度人群鼻拭子样本，采用多通道实时荧光 PCR技术检测其鼻腔 nuc-mecA基因，比较不同海拔高度人群鼻腔 nuc 基因及mecA基因差异。结果1000 m，1200 m和1400 m三个不同海拔高度地区人群鼻腔内nuc基因定植率分别为4.878％，2.899％和7.143％，差异无统计学意义（P均＞0.05）。1000 m，1200m和1400 m三个海拔高度地区人群鼻腔 mecA基因定植率分别为：14.634％，31.884％和41.837％。海拔1000 m人群与海拔1200 m人群相比，其鼻腔内mecA基因定植率差异有统计学意义（P＜0.05）；海拔1000 m人群与海拔1400 m人群相比，其鼻腔内mecA基因定植率差异有统计学显著性意义（P＜0.01）。1000 m，1200 m 和1400 m 三个海拔高度地区人群鼻腔 nuc-mecA 基因定植率分别为：0％，1.449％和3.061％，差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论随着海拔的升高，耐甲氧西林mecA基因在鼻腔内的定植显著增多。较高海拔地区居民应注意保持鼻腔等病原菌易定植部位的清洁，患病后应及时去医院就诊，不擅自使用抗生素；医务人员应合理谨慎使用抗菌药物，避免抗生素的滥用和过度医疗。

用双重聚合酶链快速鉴别葡萄球菌及其甲氧西林耐药性

目的 建立一种同时鉴别金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 (MRCNS)的快速方法。方法 利用双重聚合酶链反应 (PCR)技术同时检测金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶 (NUC)基因和编码耐甲氧西林葡萄球菌青霉素结合蛋白 (PBP2a)的mecA基因。结果 94株金黄色葡萄球菌 (SA)的NUC基因 10 0 %阳性 ,mecA基因阳性率为 4 8 9% ,药敏法MRSA的阳性率为 4 7 9% ;10 1株凝固酶阴性葡萄球菌 (CNS)的NUC基因 10 0 %阴性 ,mecA基因阳性率为 35 6 % ,药敏法MRCNS阳性率为 34 7%。结论 双重PCR技术检测葡萄球菌 (SA、CNS)及其甲氧西林耐药性具有简便、快速、敏感和特异的特点 。

单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR检测方法建立

根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列和金黄色葡萄球菌的nuc基因序列各设计一对引物和一条探针,建立基于TaqMan探针的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法。该方法对所有目标菌株均产生特异性扩增曲线,其他非目标菌均不产生扩增曲线,具有较强的特异性。且该法对阳性重组质粒pMD18-hlyA和pMD18-nuc同时定量扩增的敏感度分别为19.5拷贝/μL和18.7拷贝/μL。同步检测人工染菌肉样中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的最低检出限均为102CFU/g。

应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究

建立环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列中的保守区域设计了4条特异性引物,在65℃等温条件下,45 min即可扩增出梯形条带。LAMP检测金黄色葡萄球菌纯培养物的灵敏度为54 CFU/mL。对11株细菌进行LAMP扩增,仅3株金黄色葡萄球菌得到阳性结果。应用该方法对240份鸡蛋样品进行检测,检测结果与国标方法相符合,12份蛋壳金黄色葡萄球菌检测阳性,蛋内容物均未检出。LAMP检测金黄色葡萄球菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中金黄色葡萄球菌的有效手段。

基于PCR的金葡菌准确检测方法的建立及应用

目的建立基于PCR的金葡菌准确检测方法。方法选择nuc基因的一段保守序列并设计引物。采用PCR扩增技术对117株金葡菌的nuc保守区域进行扩增,然后采用焦磷酸测序对PCR产物进行特异性检测。同时采用传统细菌分离培养法和PCR扩增nuc基因法对16份生鸡肉样品进行金葡菌检测。结果建立的检测方法可准确鉴定117株金葡菌,准确率100%。在16份生鸡肉样品检测中,PCR法检出6份金葡菌阳性样品,阳性率为37.5%;传统细菌分离培养法检出5份阳性样品,阳性率为31.3%。结论建立的基于PCR的检测方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可适用于金葡菌的准确检测。

EMA-PCR检测金黄色葡萄球菌活菌的方法

根据金黄色葡萄球菌(SA)耐热核酸酶编码基因(nuc基因)设计特异性引物,对试验菌株进行PCR检测,结果显示,金黄色葡萄球菌扩增出大小为480bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,从而使检测结果往往出现很高的假阳性。本试验利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的EMA-PCR方法,较传统PCR大大提高了检测的准确性和可靠性,该方法检测灵敏度可达15CFU/mL。

二重实时PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的建立二重实时聚合酶链反应(duplex real-time PCR)快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。方法采用二重SYBR Green实时PCR快速检测MRSA的决定基因mecA和金葡菌的种特异性基因nuc,经熔解曲线分析鉴定产物。结果所有MRSA菌株的熔解曲线均呈现mecA、nuc基因特异性的峰,甲氧西林敏感的金葡菌仅有nuc峰,耐甲氧西林的表葡菌仅有mecA峰,甲氧西林敏感的表葡菌与其他菌种的菌株无特异峰出现;当MRSA菌浓度达102cfu/ml时就可检出。在131株金葡菌中,30.53%(40/131)耐药;二重实时PCR扩增mecA基因29.01%(38/131)阳性,nuc基因100%阳性。单引物与二重实时PCR两者阳性扩增符合率为100%。结论对mecA、nuc基因进行二重实时PCR能准确、快速地鉴定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶阴性的葡萄球菌。

牛乳房炎金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速、可视化的牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)环介导等温扩增技术(LAMP),根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,分别优化反应条件和反应体系,进行特异性和灵敏度试验,并用优化后的方法对临床分离的金黄色葡萄球菌样品进行检测。结果表明,建立的方法可以在64℃反应60 min,得到清晰的梯状条带;反应产物经10×SYBR GreenⅠ染色后,肉眼直接观察或是紫外线照射之后均可判定结果;敏感性试验表明,与常规PCR相比,该方法检测到的金黄色葡萄球菌最低浓度为1×101 CFU/mL,灵敏度提高了100倍;该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌均无交叉反应;31份临床分离的金黄色葡萄球菌样本检测的结果表明,该方法与传统的PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法特异性、灵敏度良好,可用于临床牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染的检测。

人钙周期素结合蛋白基因亚细胞定位载体的构建和鉴定

目的构建编码人钙周期素结合蛋白(hCacyBP)基因的亚细胞定位载体并进行序列测定。方法 hCacyBP的模板来自人结肠癌细胞株HCT-116的cDNA序列,根据hCacyBP基因序列设计合成引物,采用PCR方法扩增编码hCacyBP的基因片段;将hCacyBP基因定向克隆到亚细胞定位载体pCMV/myc系列:pCMV/myc/nuc(胞核定位载体)、pCMV/myc/cyto(胞质定位载体)。转化E.coli DH5α感受态细胞,在氨苄青霉素阳性LB培养基平板上筛选出阳性克隆。重组质粒经PCR及双酶切鉴定并进行序列测定。结果从HCT-116的cDNA模板扩增684 bp的hCacyBP基因片段,分别构建重组质粒pCMV/myc/nuc-hCacyBP、pCMV/myc/cyto-hCacyBP,PCR及双酶切鉴定产物大小与预期值相符合,测序分析进一步表明所克隆的基因为编码hCacyBP的基因片段。结论成功构建hCacyBP基因亚细胞定位载体,这将为研究结肠癌胞核、胞质内的hCacyBP功能和研究该基因异常高表达与结肠癌发生发展的关系奠定实验基础。

Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Food by Loop-mediated Isothermal Amplification

[ Objective ] This study was to investigate the creditability of applying loop-mediated isothermal amplification method （LAMP） to detect Staphylococcus aureus in dairy products. [ Methods] The primers for heat resistant nuclease gene （nuc） of Staphylococcus aureus were designed for establishing the LAMP method for rapidly detecting Staphylococcus aureus. [ Results ] The results of LAMP detection on Staphylococcus aureus in various dairy products were completely identical with that by bacterial isolation test; meanwhile it has a high specificity and a 10-fold sensitivity over the hemi-nested PCR. [ Conclusion] LAMP can be used for the detection of Staphylococcus aureus in dairy products.

恒温隔绝式聚合酶链式反应检测食品中金黄色葡萄球菌

建立一种恒温隔绝式聚合酶链式反应(insulated isothermal polymerase chain reaction,iiPCR)检测食品中金黄色葡萄球菌的方法。根据nuc基因设计特异性引物、探针,并探索针对食品样品快速提取金黄色葡萄球菌模板DNA的方法;通过优化引物、探针及模板的用量,对iiPCR的特异性、灵敏度、稳定性进行评价,并利用该方法和传统PCR方法对人工污染样品和实际采集食品样品中的金黄色葡萄球菌进行检测和比较。结果表明:水浴法因操作简便、耗时短、仪器要求不高,适合快速提取模板DNA;建立的iiPCR具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的特点,且与其他菌无交叉反应;对人工污染猪肉样品和牛奶样品中的金黄色葡萄球菌,iiPCR方法可在培养至第6小时完成检测,检出限为10^(3) CFU/mL和10^(2) CFU/mL,传统PCR方法8 h后完成检测,检出限为10^(5) CFU/mL;针对实际采集的食物样品,验证实验表明iiPCR方法在培养至第6小时的检出结果与传统PCR在培养至第12小时以及传统培养方法培养至第16小时的检出结果一致。证明建立的iiPCR方法能够更快速准确检测食品中金黄色葡萄球菌。

ICU耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速监测及防控

目的了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在ICU的定植、分布及其防控效果。方法新进入ICU病房患者即刻采鼻前庭拭子和72h后符合呼吸道感染指针患者的吸痰导管标本。采用荧光PCR快速检测mecA、nuc基因。并定期对医护人员鼻腔、手等相关环境标本跟踪监测防控。结果 MRSA阳性率检出率:患者鼻前庭拭子为9.9%,吸痰导管为2.7%;医护人员鼻前庭拭子为7.1%、手为4.0%、袖口为4.4%;MRSA阳性医护人员与患者鼻腔采用莫匹罗星擦拭,手加强消毒后MRSA检出率均为0.0%,但每季度医护人员鼻腔MRSA仍有检出。结论 PCR方法阳性率明显高于常规培养方法。鼻腔前庭是MRSA的主要定植部位,是主要感染源,手是重要传播途径,监测重症监护室患者鼻腔前庭及医护人员的鼻腔前庭、手是控制MRSA院内感染的重要防控目标。

21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的PCR检测

为检测某鸡场21日龄鸡胚金黄色葡萄球菌感染情况,针对其特有的耐热核酸酶基因(Nuc)设计并合成1对引物进行PCR扩增,建立特异性检测金黄色葡萄球菌的PCR方法.对18个21日龄鸡胚培养、分离,获得18株疑似金黄色葡萄球菌菌落.用建立的PCR方法对18份疑似样品进行扩增获得4份金黄色葡萄球菌的阳性扩增,证实该鸡群21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的感染率为22%(4/18).本文中基于Nuc基因建立的PCR检测方法是检测鸡胚中金黄色葡萄球菌快速、特异的分子生物学方法.

实时荧光PCR直接检测样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌应用研究

目的探讨实时荧光PCR直接检测病人样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的应用价值。方法对80例经VITEK2COMPACT药敏鉴定系统鉴定为有金黄色葡萄球菌生长(其中MRSA40例,MSSA40例)及20例未检出金黄色葡萄球菌的患者样本进行实时荧光PCR扩增,检测样本中金黄色葡萄球菌特异性核酸片段(耐热核酸酶基因nuc)及耐药基因(mec A)并与药敏鉴定比较,判断实时荧光PCR法检测MRSA的敏感性及特异性;对于两种方法检测结果不一致的18例样本重新接种培养,收集金黄色葡萄球菌菌株进行实时荧光PCR扩增,检测nuc基因及mec A基因,以期发现两种方法检测结果差异原因。结果 100例临床样本两种方法检测结果一致共82例,其中MRSA一致40例,MSSA一致22例,非金葡20例;两种方法检测结果不一致18例,均为PCR基因检测为MRSA而药敏鉴定为MSSA。MRSA检测药敏鉴定阳性40例,检出率为40%,PCR基因检测阳性58例检出率为58%;PCR基因检出率明显高于药敏鉴定,二者结果差异有显著性(P<0.05);以药敏鉴定为标准,PCR基因检测MRSA的敏感性为100%,特异性为70%;18例金黄色葡萄球菌菌株实时荧光PCR检测MRSA结果与药敏鉴定一致。结论实时荧光PCR直接检测患者样本中MSSA具有高度敏感性及特异性,但检测MRSA会受到样本中其他含有mec A基因菌的干扰,对于临床结果解释需慎重。即便如此,该方法对于MRSA检测在院感防控方面仍有重要意义。

水稻抽穗期控制候选基因的SNP/InDel多态性分析

抽穗期是水稻的一种重要农艺性状,但其遗传控制机理还不清楚。本文利用数据库搜索的方法,搜索并分析了30个与拟南芥光周期调控途径花期控制基因同源的水稻基因。利用水稻多态性数据库,得到了发生在这些基因以及Hd6、Ehd1、OsSOC1上的820个SNP及191个InDel位点。分析表明,这些位点不是平均分布到每个基因上。SNP/InDel含量较高的基因存在SNP/InDel的热点片段。14.1%的SNP位点,及7%的InDel位点分布在基因的编码区。本文也分析了侯选基因侧翼5Kb范围内的SNP/InDel多态性位点。按照侧翼多态性位点数目的分布可以将侯选基因分成4种类型,即两侧保守型、两侧热点型、单侧热点型、一侧热点一侧保守型。