猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增HBKM2株的ORF7基因,然后利用DNA Star软件包对克隆的序列进行序列分析,将ORF7基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG上,构建重组表达质粒pKG-N。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21,并经IPTG诱导表达,最后利用Western-blot对表达蛋白的免疫反应活性进行鉴定。[结果]HBKM2毒株的ORF7基因长约372 bp;序列分析表明与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的同源性达99%以上;SDS-PAGE表明克隆的ORF7基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达;Western-blot分析表明,重组蛋白GST-N能够与PRRSV高免猪血清发生特异性的免疫反应。[结论]成功地扩增了ORF7基因,且GST-N融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析。双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N。再转化至BL21宿主菌,对诱导表达条件(IPTG质量浓度、诱导时间、诱导温度)进行优化。结果显示,在37℃、0.2 mmol/LIPTG诱导5 h可实现重组N蛋白的高效表达。该重组N蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,Western-blotting分析显示,重组的N蛋白与PRRSV阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组N蛋白具有较好的反应活性。

猪生殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因的表达

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T-M-N中亚克隆至pBV220原核表达载体上,成功构建了重组表达质粒pBVM-N。将pBVM-N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,重组菌经温度敏感诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白,与M基因表达产物一致;经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因未获表达。

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT-PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(orf 7),克隆到pMD18-T载体构建成重组质粒pMD18N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCC VR-2332株的同源性为100%,表明orf 7 是PRRSV基因组内很保守的序列;将orf 7亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建成重组质粒pGEX-KGN,用pGEX-KGN转化表达菌株BL21,经SDS-PAGE和 Western-blot分析表明:克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础。

云南香猪PRRSV分离株ORF7基因遗传变异分析

为了解2014年云南省香猪群体中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特征,将疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病例肺脏和淋巴结研磨处理后接种Marc-145细胞进行盲传,传至第2代48 h时出现2株病毒致Marc-145细胞聚集融合、巨细胞等病毒致细胞病变(CPE)效应现象,将其命名为YN-2XZ1和YN-3XZ2。细胞冻融3次后,使用Reed-Muench法计算病毒的半数感染力(TCID_(50))分别为10^(6.75),10^(6.05)TCID50/100μL。对ORF7基因进行序列测定、分析及N蛋白的免疫印迹(WB)检测,并与美洲经典毒株VR-2332、国内2001-2014年部分序列进行比对结果显示,本次获得的2株PRRSV之间核苷酸同源性为100%,与国内流行的变异毒株进化同步,说明目前云南香猪群中PRRSV以变异毒株为主,可能不具有高暴发性和高致病力,不会引起重大经济损失和社会恐慌,但仍需对此加以关注。通过磷酸化分析得出,暴发HP-PRRSV前N蛋白35位丝氨酸磷酸化概率67.4%~99.8%,暴发HP-PRRSV后N蛋白35位丝氨酸磷酸化概率低于50%,提示该位点氨基酸不易于磷酸化可能与NSP-2蛋白基因缺失从而引起HP-RRSV有关,需进一步研究验证。

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。