硼替佐米与obatoclax双重阻断蛋白质降解途径对人急性T淋巴白血病细胞具有协同抗肿瘤作用

目的探讨硼替佐米联用obatoclax对人急性T淋巴白血病细胞Jurkat是否具有协同抗肿瘤作用。方法 MTT法检测单用硼替佐米和联用Bcl-2抑制剂(obatoclax,AT-101和ABT-199)对Jurkat细胞活力的影响。采用Western blot方法检测药物对Bcl-2家族蛋白、LC3B、p62、ubiquitin、BiP/Grp78、p-JNK、p-p38和CHOP蛋白表达的影响。硼替佐米和Bcl-2抑制剂对细胞凋亡的影响。实时荧光定量PCR检测未折叠蛋白反应(UPR)关键调节因子的mRNA表达水平。斑马鱼异种移植模型研究单药以及两药联用的体内抗肿瘤作用。结果单用硼替佐米和Bcl-2抑制剂均可抑制Jurkat细胞活力,但联用时仅obatoclax与硼替佐米具有协同细胞毒作用,引起细胞凋亡增多。obatoclax阻断自噬流,伴随LC3B-II和p62的蓄积。此外,单用硼替佐米和obatoclax可诱导泛素化蛋白的蓄积,两药联用对泛素化蛋白蓄积具有协同作用,与药物联用的协同细胞毒作用实验结果一致。硼替佐米和obatoclax联用对蛋白酶体和自噬的双重阻断触发了未折叠蛋白反应,诱导细胞凋亡。内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)可减弱硼替佐米和obatoclax联用的细胞毒作用,减少细胞凋亡。在斑马鱼体内联用硼替佐米和obatoclax显著地减少肿瘤灶形成。结论硼替佐米与obatoclax联用双重阻断蛋白质降解途径对人急性T淋巴白血病细胞具有协同抗肿瘤作用。

硼替佐米联用obatoclax协同诱导人急性B淋巴细胞白血病细胞株Nalm-6细胞凋亡

目的探讨硼替佐米分别与3种Bcl-2抑制剂(obatoclax、AT-101、ABT-199)联用诱导人急性B淋巴细胞株Nalm-6细胞凋亡的协同作用。方法应用MTT法分别检测3种Bcl-2抑制剂单用或联用硼替佐米作用于Nalm-6细胞48 h后的细胞活力。通过流式细胞术和蛋白质印迹分析分别检测不同药物单独或联合作用于Nalm-6细胞后的细胞凋亡情况及Bcl-2家族蛋白、泛素、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、p62、免疫球蛋白结合蛋白(Bip)、磷酸化p38、磷酸化JNK、C/EBP同源蛋白(CHOP)等蛋白的表达情况。同时利用qRT-PCR检测硼替佐米和obatoclax联用后细胞的内质网应激反应关键基因Bip、CHOP、活化转录因子(ATF)4、ATF6、肌醇需求酶1α(IRE1α)、X-盒结合蛋白1(XBP1)的表达水平。最后通过MTT和流式细胞术检测内质网应激反应抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)是否可以逆转两药联用诱导的细胞凋亡。结果硼替佐米和3种Bcl-2抑制剂单用均可降低Nalm-6细胞的存活率。3组药物联用实验组中,仅有obatoclax+硼替佐米表现出协同细胞毒性作用,其余两组并无此现象。Obatoclax通过增加LC3B-Ⅱ、p62蛋白的表达水平抑制Nalm-6细胞的自噬活性。与单药相比,硼替佐米和obatoclax联用后泛素化蛋白的表达显著上调。硼替佐米联用obatoclax可同时抑制自噬和泛素蛋白酶体活性,造成大量蛋白蓄积,进而激活内质网应激反应,最终诱导Nalm-6细胞凋亡。内质网应激抑制剂TUDCA可削弱硼替佐米和obatoclax联用诱导的细胞凋亡。结论硼替佐米联用obatoclax可同时抑制自噬和蛋白酶体活性,并激活内质网应激反应协同诱导人急性B淋巴细胞白血病细胞凋亡。

Obatoclax与MG-132对食管癌细胞CaES-17的协同抗肿瘤作用

目的探讨obatoclax联用MG-132对人食管癌细胞是否具有协同的抗肿瘤作用。方法 MTT法检测obatoclax与MG-132对人食管癌细胞Ca ES-17的细胞毒作用,根据IC50确定两药联用的浓度比(1∶2.4),将两个药物从4 IC50的作用浓度起倍比稀释,用Compu Syn软件计算两药的联用指数(CI)。采用Western blot方法研究药物对ubiquitin表达、PARP蛋白剪切、caspase-9蛋白剪切、phospho-Histone H3蛋白及phospho-Aurora A/B/C蛋白表达的影响。采用流式细胞术检测细胞早期凋亡(Annexin-V阳性率)及细胞周期的影响。结果 Obatoclax与MG-132联合处理人食管癌细胞Ca ES-17,对细胞抑制率为50%及95%时相对应的CI值分别为0.296及0.104,具有明显的协同抗肿瘤作用。单用obatoclax或MG-132均能诱导ubiquitin表达增加、PARP及caspase-9发生剪切,且联用组与单用组相比有统计学差异(P<0.05);联用组phospho-Histone H3蛋白增加与单用组相比有统计学差异(P<0.05);phospho-Aurora A/B/C蛋白表达的增加也与单用obatoclax相比有统计学差异(P<0.05),与单用MG-132相比无明显改变(P>0.05)。同时,联用组Annexin-V阳性率及sub-G1期及G2/M期细胞百分比与单用组相比都显著增加,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Obatoclax联用MG-132对人食管癌细胞Ca ES-17具有协同抗肿瘤作用,且与诱导肿瘤细胞发生凋亡及G2/M期阻滞有关。

低氧条件下奥巴克拉联合吉西他滨对乳腺癌细胞的作用

目的:研究在低氧条件下,奥巴克拉(OBX)联合吉西他滨(GEM)对乳腺癌细胞MCF-7、BT-20的细胞活性、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法:选取乳腺癌细胞MCF-7与BT-20细胞,分组为正常氧组,低氧组,GEM组,OBX+GEM组。正常氧组:37℃,5%CO 2培养箱培养24 h与48 h;低氧组:37℃,1%O 2,5%CO 2,94%N 2条件下培养24 h与48 h;GEM组:37℃,1%O 2,5%CO 2,94%N 2,加入终浓度为10μmol/L的GEM培养24 h与48 h;OBX+GEM组:7℃,1%O 2,5%CO 2,94%N 2,加入终浓度为10μmol/L的GEM与终浓度为50 nmol/L的OBX培养24 h与48 h。利用Western blot检测正常氧及低氧条件下MCF-7与BT-20细胞中低氧诱导因子(HIF-1α)的表达;利用CCK-8实验检测各组中MCF-7与BT-20细胞活性,每组设置15个复孔;利用划痕实验检测各组MCF-7与BT-20细胞迁移能力,每组设置6个复孔;利用Western blot检测各组MCF-7细胞中vimentin、E-Cadherin及p53蛋白的表达。结果:HIF-1α在低氧条件下培养的细胞中的表达远远高于其在正常氧条件下培养的细胞中的表达(P<0.05),说明低氧条件成功;与低氧组相比较,GEM可降低MCF-7与BT-20细胞迁移能力和细胞活性(P<0.05),减少细胞中vimentin的表达(P<0.01),促进E-Cadherin和p53的表达(P<0.01);与GEM组相比较,OBX联合GEM组可明显降低细胞活性和MCF-7与BT-20细胞的迁移能力(P<0.01),显著降低细胞中vimentin的表达(P<0.01),显著升高E-Cadherin和p53的表达(P<0.01)。结论:在低氧条件下,OBX联合小剂量GEM可显著抑制乳腺癌细胞的生长、迁移、侵袭,增强GEM对乳腺癌细胞的促凋亡作用,具体机制尚需要进一步研究。

奥巴克拉联合5-氟尿嘧啶对低氧性胰腺癌细胞上皮间质转化的影响

目的:研究在低氧条件下,奥巴克拉(obatoclax)联合5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)对胰腺癌细胞株Bx PC-3细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的影响。方法:细胞分组为低氧组、5-FU组、obatoclax+5-FU组,利用MTT法检测各组Bx PC-3细胞增殖活性;利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)与Western blot检测各组Bx PC-3细胞中EMT相关基因与蛋白的表达情况。结果:在低氧条件下,obatoclax联合5-FU可抑制Bx PC-3细胞的增殖活性,且具有时间依赖性;obatoclax联合5-FU可进一步促进EMT的管家基因,转录因子Snail与Slug的表达升高;obatoclax联合5-FU促进上皮标记E-Cadherin的表达升高,及间质标记N-Cadherin、Fibronectin、Collagen Ⅰ、Vimentin的表达下降。结论:在低氧状态下obatoclax联合5-FU可抑制胰腺癌Bx PC-3细胞的增殖活性,可通过抑制转录因子Snail与Slug的表达,上调上皮标记E-Cadherin的表达,下调间质标记N-Cadherin、Fibronectin、Collagen Ⅰ及Vimentin的表达,从而抑制肿瘤细胞上皮向间质的转化,进而降低肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。

奥巴克拉联合5-氟尿嘧啶对低氧性胰腺癌细胞凋亡的作用研究

目的:研究在低氧条件下,奥巴克拉(obatoclax,OBX)联合5-fluorouracil(5-FU)对胰腺癌HPAC细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:建立低氧条件;采用Western blot检测正常氧及低氧条件下HPAC细胞中HIF-1α抗体的表达;Hoechst 33258染色检测OBX在正常氧及低氧条件下对胰腺癌细胞凋亡的影响;细胞分组为低氧组、5-FU组、OBX+5-FU组,MTT检测各组中细胞增殖活性,Western blot检测各组中HIF-1α、Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果:低氧条件下HIF-1α的表达显著高于其在正常氧条件下的表达,说明低氧条件成功;在低氧条件下,OBX诱导胰腺癌HPAC细胞凋亡的能力增强,凋亡率增加,且呈一定的剂量依赖关系;低氧条件下5-FU可抑制胰腺癌细胞活力,降低细胞中HIF-1α、Bcl-2的表达,促进Bax的表达;OBX联合5-FU组,细胞活力显著降低,HIF-1α、Bcl-2的表达进一步下降,Bax的表达明显升高。结论:在低氧条件下,OBX联合5-FU可通过抑制HIF-1α和Bcl-2的表达,促进Bax的表达,诱导细胞凋亡而抑制胰腺癌HPAC细胞的增殖。