布鲁氏菌外膜蛋白OMP25和OMP31免疫学研究进展

布鲁氏菌病会导致家畜流产、不育等,严重损害养殖户的经济效益,同时对人类健康也产生威胁。近年布鲁氏菌病的频繁暴发对公共安全造成了巨大的威胁,因此,寻找更有效的方法来检测、预防布鲁氏菌病是关键。布鲁氏菌的外膜蛋白与布病的发病机制密切相关,其中OMP25和OMP31是布鲁氏菌的主要外膜蛋白,也是布鲁氏菌的重要毒力因子。目前,已有研究采用OMP25和OMP31评估布鲁氏菌的感染状况,并成功制造了重组外膜蛋白。本文回顾国内外学者对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25和OMP31免疫学研究现状和进展,旨在为布鲁氏菌的检测和疫苗开发提供理论支持。

羊布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的基因克隆、原核表达及其对小胶质细胞凋亡的影响

目的本研究旨在构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的原核重组质粒pET-30a-omp31,表达并纯化Omp31融合蛋白,初步探讨布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小胶质细胞凋亡的影响。方法对羊种布鲁氏菌Omp31基因进行PCR扩增,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a上,构建原核表达重组质粒pET-30a-omp31,表达、纯化布鲁氏菌Omp31融合蛋白,并用Omp31融合蛋白刺激小鼠小胶质细胞株BV2,利用流式细胞术分析其对小胶质细胞凋亡的影响。结果经过双酶切及测序验证证明成功构建了Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31,将其进行蛋白的诱导表达、纯化,得到了较纯的Omp31融合蛋白,其融合蛋白的分子量为31kDa左右。将Omp31蛋白刺激小鼠小胶质细胞,发现不同浓度Omp31蛋白刺激组的细胞凋亡率均低于空白对照组(P<0.05)。结论通过基因克隆技术成功构建了Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31,并对其进行蛋白诱导表达、纯化、复性后得到了Omp31融合蛋白,Omp31融合蛋白能够抑制小胶质细胞的凋亡。

重组布氏杆菌BP26蛋白和OMP31蛋白作为间接ELISA诊断抗原的研究

目的传统布氏杆菌病血清学方法因其抗原构成复杂,存在较严重的交叉免疫反应性,导致结果判定困难。BP26及OMP31分别为布氏杆菌细胞周质蛋白及外膜蛋白,在感染牛、绵羊、山羊、犬和人类均为优势免疫原,且在抗原性上具有较好的布氏杆菌种属特异性。方法以大肠杆菌表达、纯化的BP26和OMP31重组蛋白为包被抗原,初步建立了检测血清特异抗体的间接ELISA方法,并以现地牛布氏杆菌普查检测血清100份为样本,与传统的试管凝集试验进行了比较研究。结果试管凝集试验血清样本阳性率为15%(15/100);BP26包被抗原ELISA检测判为阳性的12个样本中有11为试管凝集反应阳性,相对阳性率为73.3%,二者阳性符合率为92%(11/12);而采用OMP31为包被抗原,阳性检出率为0(图5)。结论被检测区域阳性牛主要感染布氏杆菌为牛种布氏杆菌(B.abortus天然缺失OMP31基因);BP26作为间接ELISA包被抗原用于牛布氏杆菌血清学检测具有良好的特异性及较好的敏感性。

羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。

布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。

布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株的构建与鉴定

为了构建布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,采用PCR方法分别从亲本株16 M上扩增omp31基因的侧翼看序列及枯草芽孢杆菌SacB基因,并将所得片段与pMD18-T载体相连并测序,利用双酶切的方法分别将其连入自杀载体pGEM-7zf+,获得亚克隆pGEM-7zf+-Δomp31-SacB。将所构建好的自杀载体通过电转化入布鲁氏菌16M感受态细胞中,经2次同源重组后筛选出16MΔomp31基因缺失株,并对获得缺失株进行遗传稳定性检测。结果显示:成功获得布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,该缺失株在15代内未发生回复性突变。本研究为今后研究布鲁氏菌抗凋亡机制奠定基础。

羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。

布鲁氏菌OMP25与OMP31蛋白的表达及其间接ELISA诊断试剂盒研制

目的为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法。方法本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-OMP25与pET-OMP31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,OMP25与OMP31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测。结果纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了OMP25与OMP31蛋白最佳配比为4∶1、抗原最佳包被浓度为10μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1∶50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测。结论研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测。

布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因克隆及番茄转化

作为发展可食性疫苗的第一步,将猪源布鲁氏菌蛋白OMP31的编码基因转入番茄,获得了转基因番茄。利用不依赖于连接反应的克隆方法(ligation-independent cloning,LIC)构建了pJG045-Omp31植物表达载体,将此表达载体通过三亲融合法转入农杆菌AGL-0中,用农杆菌介导的植物叶盘转化法转化番茄,并通过对再生植株的基因组中OMP31的编码基因扩增测序,最终筛选出5株转基因番茄。

布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆、表达和免疫学特性的初步研究

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的克隆、测序和表达,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP31基因连接入PMD-18T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP31,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用Western-blot分析重组表达的GST-OMP31的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP31原核表达载体并在大肠杆菌中表达了OMP31基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论成功表达了布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的基础。

布鲁氏菌L7/L12、OMP31基因的克隆、测序及免疫原性分析

为研制鹿布鲁氏菌病工程疫苗,根据已发表的布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12、外膜蛋白OMP31基因设计两对引物进行扩增,PCR产物连接pGEM-Teasy载体,转化DH5α后测序,并进行基因分析。结果从布鲁氏菌疫苗株中克隆出L7/L12和OMP312个目的基因,同源分析L7/L12达97.1%,OMP31达100%,免疫原性分析可作为免疫优势抗原。

利用重组外膜蛋白OMP31检测牛布氏杆菌血清抗体OMP31-ELISA方法的建立

为了研究牛布氏杆菌血清抗体快速诊断方法,试验采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31基因,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌DE3进行诱导表达,再将表达产物重组外膜蛋白OMP31纯化后作为抗原,建立检测牛布氏杆菌血清抗体的OMP31-ELISA,并对最适反应条件进行确定,然后对从河北省部分牛场采集的150份腹泻奶牛血样进行血清抗体检测。结果表明:牛布氏杆菌OMP31蛋白成功表达,表达产物能与牛布氏杆菌免疫兔血清反应;建立的OMP31-ELISA最佳工作条件为外膜蛋白OMP31抗原的最适包被浓度2.0μg/mL,酶标抗体的工作浓度1∶400,血清稀释度1∶160,以3%明胶-PBS封闭30 min。检测的150份临床血清样本中,特异性、敏感性和符合率分别为90.91%(50/55)、95.79%(91/95)、94.00%(141/150)。说明本方法特异性强、敏感性高,快速,使用方便。

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。

宁夏布鲁氏菌Omp31基因序列特征分析

目的目的对宁夏布鲁氏菌Omp31基因序列进行分析,为菌株种型鉴定和试剂研究奠定基础。方法根据Genebank公布Omp31基因序列设计引物,采用PCR扩增、电泳检测、胶回收、纯化、送基因公司双向测序,用Contig Express软件对测序结果拼接,用DNAstar软件进行结果分析。结果经PCR扩增测序得到Omp31基因全长序列大小为723 bp,编码240个氨基酸,与Genebank上羊种布鲁氏菌Omp31基因同源性达99.9%,氨基酸序列的同源性100%。通过遗传分析,分离株与参考菌亲缘关系相近,与羊种布鲁氏菌处在同一分枝。结论宁夏布鲁氏菌Omp31序列与发布的参考序列之间的同源性很高,而且与羊种布鲁氏菌处在同一分支。

猪型布鲁氏菌omp31基因的原核表达与亲和纯化

以猪型布鲁氏菌基因组作为模板进行基因序列的扩增,利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达,来研究外膜蛋白基因omp31的序列特性与重组表达情况。结果表明:猪型布鲁氏菌omp31基因的开放阅读框序列全长为723 bp,编码240个氨基酸。通过大肠杆菌原核表达,成功表达出了目标重组蛋白,利用GSTtag亲和柱进行蛋白质纯化,重组蛋白分子量与预期的55.3 kD相一致。

猪型布鲁氏菌Omp31基因的抗原表位预测与分析

布鲁氏菌的外膜蛋白在维持细胞结构方面发挥着重要作用,其中,有些外膜蛋白与细菌本身的毒性相关,成为了重要的抗原决定簇相关分子。Omp31分子就是猪型布鲁氏菌的一个重要的抗原表位分子,在研制亚单位疫苗方面有重要作用。本论文以猪型布鲁氏菌Omp31基因作为研究对象,利用DNAStar生物学软件对Omp31分子的立体结构、分子的表面可能性、亲水性、蛋白骨架区的柔韧性、分子的抗原指数进行了详细分析。结果显示:猪型布鲁氏菌Omp31分子一级结构的氨基酸序列中存在4段可能的抗原表位区段,其中,51～80氨基酸残基组成的区段和193～228氨基酸残基组成的区段的抗原指数较高,成为抗原决定簇的可能性很大。

猪型布鲁氏菌Omp31抗原表位基因的性质分析

布鲁氏菌病是一种由革兰氏阴性小杆菌:布鲁氏菌(Brucella)引起的,主要在动物中以流产和发热为表现特征的疾病.以猪型布鲁氏菌病Omp31抗原表位基因作为研究对象,对基因的种间同源性、亚型分类、结构性质、抗原表位性质等信息进行了分析,并且作出了相关预测.随着预测方法的不断完善,将会对布鲁氏菌病其它抗原表位基因的研究提供帮助,从而为该疾病的防疫、治疗提供理论依据,同时也可以促进相关疫苗的研制.

布鲁菌Omp31基因的克隆、表达及其蛋白的生物信息学分析

为了进一步研究Omp31蛋白的功能,试验利用DNAMan软件设计上、下游引物,通过PCR技术从马耳他布鲁菌M5-90株中克隆获得Omp31基因,构建原核表达重组质粒pET28a-Omp31,并转化E.coli BL21(DE3)感受态;再以IPTG诱导重组蛋白表达,进行SDS-PAGE和Western-blot检测,并运用生物信息学软件对所获得的核苷酸序列进行分析。结果表明:成功克隆了马耳他布鲁菌外膜蛋白Omp31基因,并构建出重组质粒pET28a-Omp31;经IPTG诱导,得到与预期大小相符的目的蛋白;生物信息学分析发现,Omp31蛋白核苷酸序列包括1个723 bp的开放读码框,编码240个氨基酸;该蛋白二级结构中存在大量无规则卷曲和少量α螺旋。

羊布鲁氏杆菌OMP31的真核表达及其应用分析

为了获得可在细胞内表达布鲁氏杆菌外膜蛋白31(OMP31)基因的表达载体和慢病毒,试验从羊布鲁氏杆菌M5-90疫苗株PCR获得OMP31基因,连接至p Zero Back/blunt载体,经双酶切鉴定、测序鉴定正确的基因亚克隆到p HAGE-CMV-MCS-IZs Green表达载体上,双酶切鉴定,构建含正确OMP31基因的表达载体p HAGE-OMP31,与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共转染293FT细胞进行慢病毒Lentivirus-OMP31包装;获得的Lentivirus-OMP31感染293FT细胞,利用蛋白质印迹(Western-blot)和免疫荧光(IFS)鉴定OMP31蛋白的表达及其免疫原性;LentivirusOMP31体外感染布鲁氏杆菌的宿主细胞模型单核细胞THP-1和人绒毛膜滋养层细胞JEG-3,Western-blot和IFS鉴定OMP31基因的表达,并利用流式细胞(FCM)检测细胞凋亡情况。结果表明:构建了能够在细胞内表达OMP31基因的真核表达载体p HAGE-OMP31和慢病毒LentivirusOMP31,二者感染细胞后表达的OMP31蛋白可与特异性抗体反应,具有良好的抗原性。经初步鉴定,OMP31蛋白在JEG-3细胞内表达能引起细胞凋亡。说明载体p HAGE-OMP31和慢病毒Lentivirus-OMP31可作为用于研究OMP31与布鲁氏杆菌感染相关性的试验材料。

布鲁杆菌优势抗原OMP31和BP26的B细胞表位筛选

目的筛选BP26和OMP31蛋白的B淋巴细胞线性表位,并探索该表位及其抗体在布病检测中的价值。方法构建BP26和OMP31蛋白的原核表达系统,表达、纯化重组BP26(rBP26)和OMP31蛋白(rOMP31),并以rBP26和rOMP31分别免疫BALB/c小鼠,制备能特异性结合天然OMP31和BP26蛋白的单克隆抗体;合成BP26和OMP31蛋白的重叠16肽作为抗原,多肽ELISA测定单抗;与KLH偶联的16肽作为ELISA检测抗原,检测羊的血清。结果获得纯度90%以上的rBP26和rOMP31,并制备28株能稳定分泌抗rBP26单抗,5株稳定分泌抗rOMP31单抗的杂交瘤细胞株,其中分别有11株和1株能与多肽结合,