融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。

甲型副伤寒杆菌重组蛋白OmpW的表达与鉴定

目的构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因ompW的原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpW免疫原性,了解甲型副伤寒杆菌临床菌株ompW基因携带率。方法采用PCR和T-A克隆法从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中获得ompW基因克隆并构建其原核表达系统,重组蛋白纯化后用SDS-PAGE及Western-Blotting分析。采用PCR检测95株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompW基因携带率。结果与报道的相关序列比较,所克隆的ompW基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。rOmpW免疫家兔可产生抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号。所有甲型副伤寒杆菌菌株均携带ompW基因。结论构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因ompW的原核表达系统,证明了ompW是存在于甲型副伤寒杆菌的序列保守、分布广泛的外膜蛋白基因,为进一步研究该蛋白作为多价甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原奠定基础。

禽多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆与序列分析

提取禽多杀性巴氏杆菌分离株Pm27基因组DNA,参考GenBank中Pm70株ompW基因序列设计引物,应用PCR技术扩增了细菌ompW基因,将扩增片段克隆到pMD18-T载体后测序。生物信息学分析表明,该基因编码区长度为615bp,编码204个氨基酸;氨基酸序列与参考株Pm70 OmpW蛋白的同源性最高,达98%;与睡眠嗜血杆菌的同源性77%,与琥珀酸产生菌的同源性为69.3%,与霍乱弧菌、大肠杆菌、耶尔森菌的同源性为50%左右。OmpW蛋白前21个氨基酸残基为信号肽序列,潜在的糖基化位点位于第122位氨基酸残基。

羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列(登录号:CP007040.1),使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物,选取高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段,并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增产物约为615bp,编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高,而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现,ompW蛋白分子式为C1007H1567N257O283S3,分子质量为21.90ku,理论等电点(pI)为9.16,属碱性蛋白质,疏水指数为96.57,总平均疏水性(GRAVY)为0.173(>0),属于疏水类蛋白;前21位氨基酸为信号肽,第5-27位氨基酸区域存在1个跨膜区,存在N-糖基化位点及磷酸化位点,不存在O-糖基化位点,具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位;二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%;三级结构是呈β-桶状的单聚体,隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。

变性高效液相色谱检测霍乱弧菌

变性高效液相色谱(DHPLC)是近几年刚发展起来的一种快速检测PCR扩增产物的新技术.应用该技术快速检测O1、O139、非O1、非O139群霍乱弧菌的外膜蛋白基因(ompW).根据霍乱弧菌外膜蛋白基因的特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC进行快速检测.以54株参考菌株做特异性检测.在丹东口岸国境外环境水体采集水样310份,以PCR-DHPLC和常规分离培养进行了比较,对丹东口岸国境外环境水体霍乱弧菌感染状况进行了检测,并对分离株进行了ompW基因测序.试验结果表明该方法有很好的特异性,310份水样中经PCR-DHPLC检测出58株霍乱弧菌的分菌株,阳性率为19%,与常规分离培养比较,符合率为100%.分离株的ompW序列与Genbank中的存在1%～3%的差异.这种检验方法特异性强,简便快捷,为霍乱防治提供了一种有效的检测新手段.

鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因扩增及序列分析

为了解不同鸭源鸡杆菌菌株外膜蛋白W基因(ompW)的差异性,对不同地域32株鸭源鸡杆菌ompW基因进行扩增、测序,并应用DNAstar/MegAlign和MEGA.5.05软件对其进行比对及遗传进化分析。结果表明:ompW基因存在于所有检测的鸭源鸡杆菌中。全长在630~711bp,编码209~236个氨基酸。与参考株UMN179的ompW核苷酸同源性为88.7%~100%,氨基酸同源性为86.7%~99.6%。不同来源的鸭源鸡杆菌的核苷酸同源率为84.1%~100%,氨基酸同源性为78.7%~99.6%。进化树分析表明,鸭源鸡杆菌ompW序列差异与分离地理位置,毒力无明显的相关性。

多酶恒温核酸快速扩增技术在霍乱弧菌检测中的应用

霍乱弧菌(Vibriocholera)是水产养殖中常见的致病菌,建立起快速、灵敏、便捷的检测方法对加强水产养殖病害监测和防控工作有重要意义.本研究利用多酶恒温核酸快速扩增技术,根据霍乱弧菌外膜蛋白基因ompW的保守序列,设计6对引物组,对引物特异性进行验证;并设计不同的模板浓度梯度,以验证该方法的灵敏度.结果表明,本研究确定的引物对霍乱弧菌检测的特异性强,灵敏度高(可低至10 fg/μL),无需特殊设备,适合实验室或者现场的快速检测要求.

维氏气单胞菌TH0426株ompW基因的克隆、生物信息学分析及其原核表达

为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)ompW基因的生物信息学特性及相关功能,试验克隆了维氏气单胞菌ompW基因片段,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级及三级结构,并对其进行原核表达及反应原性检测。结果显示,ompW基因全长594 bp,编码197个氨基酸,TH0426株ompW基因与A.veronii B5B6株属于同一分支;该蛋白属于外膜蛋白,在19~29位氨基酸之间有一个典型的疏水区域,不存在跨膜区、信号肽,二级结构以β折叠与无规则卷曲为主。Western blot结果显示OmpW重组蛋白能与鼠抗维氏气单胞菌(A.veronii)TH0426株血清发生特异性结合。综上,OmpW重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究A.veronii疫苗奠定基础。

鸭源鸡杆菌ompW、gtxA双基因缺失株的构建及其相关特性分析

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)是家禽中常见的条件性致病菌,主要引起蛋鸡生殖道疾病,造成产蛋量下降。【目的】为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白(OmpW)对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响。【方法】本研究采用自然转化法对突变株RZ△ompW进一步缺失gtxA构建突变株RZ△ompW△gtxA,通过分析其生长特性、黏附能力、引起细胞凋亡程度及对小鼠致病性等,探究其与生物学特性及致病性可能的关系。【结果】结果显示,RZ△ompW△gtxA能稳定遗传gtxA的缺失;单双基因突变株溶血活性均消失、与RZ株相比菌落形态及生长速率并未出现显著改变;相比RZ、RZ△ompW和RZ△gtxA,双基因缺失株RZ△ompW△gtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力显著降低(P<0.05),诱导鸡输卵管上皮原代细胞发生凋亡的能力明显减弱,对小鼠的致病力显著降低。【结论】GtxA毒素和外膜蛋白OmpW在鸭源鸡杆菌毒力、黏附宿主细胞及诱导其细胞凋亡中起重要作用,且可能存在明显的协同关系。本研究为鸭源鸡杆菌感染机制的阐明奠定基础。