人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MELHP27ureB-omp11融合基因的重组表达载体。方法:利用分子克隆技术,扩增HpUreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a(+)进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体。结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为HpureB-omp11融合基因,由2280bp组成。与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%。结论:成功构建了MELHp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a(+)、pET28a(+)及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a(+)、pET28a(+)与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。