几种植物转基因表达载体的构建方法

表达载体的构建在植物基因工程研究中占据重要地位,直接关系到目的基因的表达效果。作者在收集整理前人的工作基础上,比较分析了5种不同载体构建方法的特点,给出了不同载体构建方法的适用性建议,期望能对植物基因工程中的载体构建工作提供有益帮助。在构建多片段连接的小载体的时候推荐用一步克隆法,在构建多片段连接的复杂的大载体时采用相应的复杂载体构建技术,在已获得无选择标记的转基因植株时采用三段T-DNA构建方法构建载体。在做基因功能验证时采用的Gateway技术,非常简单的载体构建可以采用传统的酶切连接的构建方式。现在的主流构建载体方式是利用结合其他手段的Gateway技术,未来载体的发展趋势将是无酶连接。

一种载体构建的新方法:一步克隆法

报道一种载体构建的新方法,在PCR引物设计时,相连片断设计15 bp同源序列,PCR克隆目的片段后,产生多个首尾具同源末端的片段,然后进行多片段定向连接、转化和重组子鉴定.以4片段拼接的叶绿体单交换质体载体pSMGA(pBluescriptⅡSK(+)-man-gfp-aadA)的构建为例,应用上述方法构建仅需做一次连接、转化即可.该方法设计操作相对简便,无需中间载体的构建,减少连接和转化次数.利用该法构建了10多个6 kb以内的载体,证明这是一种简便、通用、高效并值得推广的构建小载体的方法.

Sacramento模型的多步骤参数估计方法及应用

为了解决传统优化算法在Sacramento模型参数估计中存在早熟、收敛速度慢、容易陷入局部最优和传统求解过程出现模型模拟吻合度较差等问题。对于人工生成的理想水文资料,分别采用SCE-UA算法、并行遗传算法(PGA)、改进粒子群算法(SMSE-PSO)和提出的免疫克隆选择算法(ICSA)进行参数率定,比较结果选出最优算法,同时,将最优算法与多步骤参数估计方法结合进行实测资料的洪水预报,并比较单步骤与多步骤方法的预报效果。结果表明:ICSA收敛结果更好,效率和精度更高,将其与多步骤参数估计结合提高了洪水预报精度。ICSA算法和多步骤参数估计方法结合为Sacramento模型参数估计提供了一条新途径。

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。

茶树叶片叶绿素含量与叶色值相关性研究

用SPAD - 5 0 2仪和比色法分别测定了 8个茶树无性系品种的叶色值与叶绿素含量。实验数据的分析结果显示 :8个无性系品种的SPADR大小和叶绿素含量有关 ,其中与叶绿素a、b浓度比相关性最强 ,叶绿素b的浓度是影响SPADR的次重要因子 ,该指标对SPADR的影响主要是通过影响a b来实现的。最后以SPADR为指标采用最小距离法对各品种进行了聚类分析。

多边界条件下热泵利用循环水余热的CPCS-RBF预测控制

循环水余热回收系统中,热泵热网水出口温度在跟踪供热负荷需求时,在受驱动蒸汽量的调节的同时,往往易受热网回水、循环水等工况变化的影响,传统PID控制方式超调量大、负荷跟踪能力差。提出一种混沌变异克隆选择-径向基函数(CPCS-RBF)直接多步预测控制策略,以热泵热网水出口温度预测值与设定值差值为目标函数,利用CPCS优化算法求取目标函数最小时的驱动蒸汽最佳值。预测模型由2个RBF神经网络结合热泵现场运行数据构建,以提高热泵系统适应工况变化的能力;实验结果表明,该控制策略能综合学习热网回水温度、循环水温度等参数的变化,使驱动蒸汽调门超前动作,及时跟踪供热负荷需求变化的同时,适应发电负荷变化下排气余热量的波动,具有更好的节能效果和变工况适应能力。

求解函数优化问题的混合进化规划算法

提出一种混合进化规划算法,将进化规划与免疫进化中的克隆扩增相结合.该算法一方面用自适应变异步长的进化规划来有效地控制种群的整体进化,以在全局范围内进行搜索;另一方面,对于当前代中最优个体本身,利用免疫进化中的克隆扩增算子,来进行小邻域的局部细搜,从而形成两层领域搜索机制,以保证全局和局部搜索能力.仿真结果表明,该算法收敛速度快,搜索精确度高,并具有良好的全局搜索能力.

降钙素原的克隆、表达及多抗制备

目的合成降钙素原的全长基因,表达出降钙素原的融合蛋白并制备多抗,为降钙素原(PCT)的功能研究及单抗制备提供有力的实验基础。方法采用多引物人工一步合成基因技术合成降钙素原的全长基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1表达出重组蛋白,将初步纯化的蛋白免疫小鼠制备多抗并进行Western blot鉴定。结果成功表达降钙素原重组蛋白并制备其多抗,Western blot证实所制备的PCT多抗可与所获得的融合蛋白和病人血清发生特异性反应。结论成功表达降钙素原重组蛋白并制备其多抗,为明确降钙素原来源和病理生理作用的研究奠定了基础,以及为制备其单克隆抗体提供实验材料。

一种构建载体的新方法:一步式混合胶回收连接法

以构建原核表达载体重组质粒G4FPAGB1为例,介绍了一种新的载体构建方法。棉铃虫单核衣壳核多角体病毒G4毒株基因组上的Ha–FP–A片段用Hin dⅢ和Eco RⅤ双酶切,Ha–FP–B片段用XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切,绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因片段用Eco RⅤ和XhoⅠ双酶切,载体质粒p Bluescript SK(+)用Hin dⅢ和Bam HⅠ双酶切。酶切产物经电泳检测后,将所有含目的片段的胶块切下,放在同一个离心管中进行DNA回收,得到的混合DNA产物直接加入连接酶进行连接、转化。结果表明,3个目的片段均成功连接到载体质粒上。本方法可高效、简单地构建包含多个目的片段的重组质粒。

肠道病毒71型的全长cDNA感染性克隆的构建与鉴定

目的构建一株肠道病毒71型的全长cDNA克隆并验证感染性。方法用长片段高保真RT-PCR方法扩增肠道病毒71型87-2008 Xi'an株的cDNA,装入pBR322载体。将该克隆线性化,体外转录后转染RD细胞后,通过观察CPE及RT-PCR验证其感染性。随后利用空斑法测定拯救病毒的一步生长曲线。结果成功构建了肠道病毒71型87-2008 Xi'an株的全长cDNA克隆;体外转录及转染RD细胞60 h后可观察到明显的CPE现象;RT-PCR在转染RD细胞中检测到病毒的存在;成功利用空斑法测定了拯救病毒的一步生长曲线,最大滴度达到2×107pfu/mL。结论成功构建了肠道病毒71型87-2008 Xi'an株的全长cDNA克隆并验证了其感染性,同时测定了拯救病毒的一步生长曲线,与野生型病毒相近。

基于人工免疫克隆选择算法的无人机三维航迹规划

无人机航迹规划作为一个规模大、约束多、指标多的优化问题,其复杂性导致自动规划比较困难。构建了基于局部极坐标的水平航迹控制变量和基于特定平飞段飞行高度的纵向航迹控制变量,以水平航迹控制变量为优化变量,采用分步规划的策略,建立了基于人工免疫克隆选择算法的无人机航迹自动规划模型,该模型能够充分发挥计算机速度快、容量大的特点,能够对基于预处理结果的人工规划方法进行一定程度的改进。仿真结果验证了模型的可行性和有效性。

Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础.

基于FPLC-LC-MS/MS分析嗜盐古菌Haloarcula hispanica胞内类泛素化底物

本研究结合SLIC克隆技术和快速蛋白质液相色谱-高效液相色谱-串联质谱(FPLC-LC-MS/MS)法,对嗜盐古菌Haloarcula hispanica类泛素蛋白ThiS的泛素化底物和缀合位点进行鉴定分析。采用SLIC克隆法构建类泛素蛋白ThiS表达质粒/整合质粒,经转染后的菌株在DMSO呼吸作用诱导下表达并纯化His6-ThiS蛋白缀合体。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,质粒型类泛素ThiS的表达远远高于基因型菌株的表达量,而通过定点突变,将ThiS的第89号位点突变成赖氨酸K和精氨酸R,进而使用胰蛋白酶对ThiS肽段上的赖氨酸残基-双甘氨肽标签进行酶切处理,采用LC-MS/MS法鉴定其底物和底物修饰位点。鉴定得到钼喋呤合成酶MoaE,蛋氨酸亚砜还原酶MsrA和其同系物MsrB,以及Fe-S簇组装蛋白SufB等4种底物蛋白。该方法通过结合蛋白位点突变和质谱检测,能够准确、有效地检测泛素/类泛素蛋白的修饰底物及其修饰位点,为深入泛素的生物性功能研究提供了切入点。

Hsa_circ_0008957靶MiRNA预测及其表达载体构建

目的构建Ⅰ型胶原蛋白结构基因COL1A2的靶向circRNA hsa_circ_0008957其靶向miRNA的功能。方法采用circbase软件,获取hsa_circ_0008957序列,采用PCR进行circRNA克隆,通过同源重组接入circRNA表达载体pCD2.1。重组载体pCD2.1-hCOL1A2_circ_0008957通过PCR、双酶切、Sanger测序进行验证。利用circBANK,circinteractome网站进行hsa_circ_0008957靶miRNA及其功能预测。结果pCD2.1-hCOL1A2-circ-0008957重组载体构建成功。Hsa_circ_0008957预测出该circRNA不具有蛋白编码功能,其靶miRNA hsa_miR_1305,hsa_miR_140-3p,hsa_miR_421,hsa_miR_548c_3p和hsa_miR_628-3p与成骨相关,预测hsa_circ_0008957可能通过这些miRNA参与成骨分化。结论Hsa_circ_0008957通过miR-1305、miR-140-3p、miR_421、miR_548c_3p和miR_628_3p参与成骨分化,且预测COL1A2靶向miRNA与17种miRNA取交集,得出hsa_miR_618,该miRNA与肿瘤疾病相关,为后续在细胞水平上进一步验证hsa_circ_0008957的调节功能奠定了基础。

阴道毛滴虫RRas基因序列的cDNA一步克隆、表达及鉴定

目的一步克隆、表达及鉴定阴道毛滴虫RRas基因,以了解其在组织细胞定位和功能。方法用PCR方法从阴道毛滴虫cDNA文库中扩增RRas片段,用一步克隆法构建RRas-PQE-80L载体,进行菌落PCR和酶切鉴定,阳性克隆提取质粒,经测序鉴定后转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导。表达产物用NiAgarose His纯化试剂盒纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定和Western blot分析。结果从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的RRas基因片段长617bp,酶切及DNA测序证实RRas-PQE-80L重组质粒构建正确。表达的融合蛋白分子质量单位约为23.6ku,该蛋白能被抗His标签抗体识别。结论成功构建重组原核表达质粒RRas-PQE-80L载体,并能在E.coli BL21中表达,表达蛋白具有反应原性。

热带假丝酵母高效利用甘油研究

目的：热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率。方法：以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶（gk）为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因（kanr）连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP。结果：经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4%,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis1798对甘油的吸收利用。此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7%。结论：通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率。

pH对水稻土全程氨氧化细菌丰度和群落结构组成影响

土壤pH被认为是影响AOA和AOB生态位分化的重要因子,而最近发现的全程氨氧化细菌(Comammox Nitrospira)也在土壤中广泛分布,推测pH可能也是影响全程氨氧化细菌生态位分化的重要因子.选取酸性红壤和中性紫色土发育的水稻土,采用荧光定量PCR及克隆测序技术,分析了全程氨氧化细菌Comammox Nitrospira clade A和clade B的丰度和群落组成.结果表明,酸性水稻土的Comammox clade A amoA基因的丰度比中性水稻土高了2个数量级(P<0.05),酸性水稻土的Comammox clade B的丰度也显著高于中性水稻土(P<0.05);酸性水稻土中Comammox clade A amoA基因的丰度比clade B高60倍,而中性水稻土中Comammox clade A和clade B amoA基因的丰度比约为2,这些结果表明土壤pH是影响Comammox Nitrospira丰度的重要因子.克隆测序的结果发现中性水稻土中的Comammox均属于clade A,主要隶属于Nitrospira inopinata类群;而未能检测到属于clade B的序列.酸性水稻土中的Comammox clade A主要由Nitrospira inopinata和Nitrospira nitrosa类群组成,clade B主要与土壤中发现的未培养的细菌克隆(FN395328)密切相关,结果表明Comammox Nitrospira的群落结构也受pH的显著影响.综上,pH对土壤全程氨氧化细菌的丰度及群落结构组成有显著影响,是影响其生态位分化的重要环境因子之一.