一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。

体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板

本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。

多重实时定量PCR检测BCR—ABL mRNA方法的建立

目的建立一种快速、可靠的实时定量PCR（RQ-PCR）检测BCR-ABL mRNA的方法。方法应用LightCycler技术，设计在同一PCR反应管内可扩增b3a2、b2a2、ela2几种常见的BCR-ABL转录本和b3a3、b2a3等少见转录本，并对RQ-PCR主要要素进行优化，评价优化后RQ-PCR的敏感性、特异性和可靠性。结果建立的RQ-PCR方法可检出10^3健康人单个核细胞中的1个K562细胞，最低可检出100个拷贝BCR—ABL分子。BCR—ABL和ABL的循环域值（C1）值（拷贝数）批内变异系数分别为0．68％（12．93％）和0．59％（8．60％），批间变异系数分别为1．14％（18．89％）和1．01％（12．72％）。结论RQ-PCR可作为评价慢性粒细胞白血病（CML）疾病进展、预后判断和骨髓移植后微量残留白血病监测的灵敏、可靠的方法。

实时定量RT-PCR检测激活淋巴细胞的端粒酶逆转录酶的表达

目的:研究激活淋巴细胞和未激活淋巴细胞的端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的表达情况。方法:运用定量RT-PCR法检测分别代表激活淋巴细胞和未激活淋巴细胞的43枚良性结直肠疾病的炎性系膜淋巴结和31例正常自愿者的外周血单核细胞hTERT的表达水平。另外,作为阳性和阴性对照,还检测了59对结直肠癌肿瘤组织/正常黏膜组织的hTERT表达水平。结果:炎性系膜淋巴结的hTERT表达水平比正常人外周血单核细胞的高,但没有统计学意义(P=0.07)。肿瘤组织的hTERT表达水平明显比正常组织的高(P=0.001)。结论:淋巴细胞无论激活与否,hTERT表达水平没有显著改变,与正常组织也无明显差异。

实时荧光定量PCR检测端粒酶逆转录酶mRNA在急性白血病中的表达

目的研究人类端粒酶转录酶（hTERT）在急性白血病的表达和意义。方法应用实时定量PCR（Real-time PCR）技术检测30例急性白血病骨髓单个核细胞及25例正常人骨髓单个核细胞中hTERT mRNA的表达水平，分析其表达水平与急性白血病恶性程度的关系。结果hTERT在急性白血病细胞中的中位表达量为0．00244（0～0．0320），明显高于正常人骨髓单个援细胞中hTERT的中位表达量2．79×10^-4（0～0．0078）（P〈0．001）。但在ANLL和ALL细胞中对比表达无明显差异（P=0．742）。结论在急性白血病中hTERT明显高于正常对照，hTERT是急性白血病诊断的特异性指标之一。

Real-Time PCR检测间充质干细胞源性内皮细胞eNOS、Tie-2基因表达

[目的]检测骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性内皮细胞功能基因表达水平,为骨组织工程血管化奠定基础。[方法]采用全骨髓贴壁法对BMSCs进行体外培养、纯化和扩增,用含有VEGF(10 ng.ml-1)和bFGF(2 ng.ml-1)的诱导培养液对其进行体外诱导分化3周,通过透射电镜观察内皮细胞特异性W-P小体鉴定细胞性质。以主动脉内皮细胞(VECs)为阳性对照,采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测BMSCs源性内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)与酪氨酸激酶受体(Tie-2)mRNA的相对表达量。[结果]分化后的细胞在光镜下具有内皮细胞的形态学特征;透射电镜观察显示诱导后的细胞内出现内皮细胞特异性W-P小体。RT-qPCR检测显示:实验组Tie-2mR-NA的相对表达量为0.785,eNOS mRNA的相对表达量为0.747,二者与阳性对照组目的基因的表达量没有明显差异(P>0.05)。[结论]BMSCs能够成功体外分化为内皮细胞,且具有成熟内皮细胞功能基因的表达,是构建血管化组织工程骨的理想种子细胞。

长链非编码RNA MEG3在胃癌中的表达及其与预后的关系

目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)在胃癌组织中的表达及其与预后的关系,并进一步探讨MEG3与凋亡相关蛋白P53、鼠双微基因2(murine double minute 2,MDM2)的相关性。方法:收集2012年9月至2013年6月青岛大学附属青岛市市立医院55例行手术治疗的胃癌切除标本(包括癌组织及对应的远端正常组织),实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测胃癌组织中MEG3的表达,并分析其与临床病理参数的关系;应用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测胃癌中P53、MDM2蛋白的表达水平,并分析其与MEG3的相关性。结果:lnc RNA MEG3在胃癌组织的相对表达水平(7.98±0.19)低于所对应的正常组织(9.47±0.18,P<0.05);在胃癌组织(r=-0.627,P<0.001)及远端正常组织(r=-0.807,P<0.001)中,P53与MDM2的表达呈负相关;P53与MEG3的表达呈正相关(r=0.591,P<0.05),MDM2与MEG3的表达呈负相关(r=-0.346,P<0.05);MEG3高表达者较低表达者中位生存期明显延长。结论:MEG3在胃癌发生发展过程中起抑癌基因的作用;MEG3与P53、MDM2在胃癌发生发展的生物学机制上有重要联系;检测MEG3的表达水平对胃癌预后有潜在价值。

纳米羟磷灰石/聚酰胺66对成骨细胞生物学作用的实验研究

目的研究新型纳米根管充填材料纳米羟磷灰石/聚酰胺66(nHA_PA66)对成骨细胞的生物学作用。方法以含nHA_PA66的细胞培养基(DMEM)浸提液作用于实验组细胞,DMEM培养基作用于对照组细胞,采用MTT比色法检测nHA_PA66对成骨细胞生长的影响;酶联法检测细胞ALP活性的变化;QRT_PCR测量细胞骨钙素基因表达的变化。结果实验组细胞的相对增殖率在98%～106%之间,且无量效关系,实验组与对照组间无显著性差异(P>0.05);实验组和对照组细胞的ALP活性及骨钙素基因表达相似,皆无显著性差异(P>0.05)。结论nHA_PA66对成骨细胞的生长和功能无不良影响,具有骨细胞相容性。

博尔纳病毒在宁夏的人和动物感染的检测

目的对临床VE患者以及其本人接触动物的检测,探讨BDV在宁夏地区的感染状况及感染机制,并分析BDV核酸和转化后的氨基酸序列,构建病毒种系发生的来源。方法应用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量PCR检测患者及其接触的动物的外周血单核细胞的p24和p40基因片段。对检测阳性标本进行连接测序,应用MEGA和DnaSP4.0软件对测序结果同国外的标准株HE80、H1766、strainV等进行核酸和氨基酸序列对比分析,并构建病毒基因的系统发生树。结果在60例VE患者及其接触的710绵羊中,PCR检测发现有3例阳性,阳性检出率5%;9头绵羊阳性,阳性检出率为1.27%。基因聚合分析显示人和动物BDV的核酸序列和编码氨基酸序列与德国马源性的HE80株同源性高达100%,重构基因系统发生树可见宁夏VE患者和牛羊BDV核苷酸序列与国外的标准株形成宁夏-德国-日本的混合支系,同时宁夏绵羊BDV序列也形成了一个独立的支系。结论宁夏地区人和牛羊存在BDV的自然感染,并且人的感染存在动物源性,其传染途径很可能是呼吸道的传播可能引起脑炎的非特异性的临床症状,病毒在种系发生中与德国马源性HE80株有极高的同源性,病毒可能由国外引入本土,不排除病毒株变异的可能,人和绵羊之间存在相互传染的可能。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

共轭亚油酸对脂肪代谢相关基因表达的影响

本文利用实时定量PCR的测定方法,分析了两种共轭亚油酸(CLA)异构体对3T3-L1小鼠前脂肪细胞脂肪代谢相关基因表达的影响。本研究CLA异构体的处理浓度和时间为75.4μmol/L,8 d,测定了与能量代谢、细胞凋亡、脂肪酸氧化作用和脂解作用相关的多种基因的mRNA水平。结果显示:两种异构体均能够显著提高UCP1、UCP3、Perilipin和PPARα的mRNA水平,而抑制UCP2的表达水平(P<0.01)。与cis-9t,rans-11CLA相比t,rans-10c,is-12 CLA显著提高PKA(P<0.05)、CPT-1和TNF-α(P<0.01)的mRNA水平。与对照组相比,两种CLA异构体处理组均对HSL、ATGL、ACO和Leptin的基因表达无显著影响。

结直肠癌及癌前病变hTERT mRNA定量检测及其临床意义

目的探讨结直肠癌及癌前病变组织中人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)mRNA的表达量及其临床意义。方法以实时荧光定量RT-PCR检测95例结直肠癌、50例结直肠腺瘤息肉、25例结直肠增生性息肉、21例溃疡性结肠炎及20例正常结直肠黏膜组织中h TERT mRNA的表达量;分析结直肠癌组织中h TERT mRNA表达量与肿瘤病理特征及预后的关系。结果结直肠癌组h TERT mRNA表达量显著高于结直肠腺瘤息肉组、溃疡性结肠炎组、结直肠增生性息肉组和正常对照组(P<0.01);腺瘤息肉中伴高级别上皮内瘤变者h TERT mRNA表达量明显高于伴低级别上皮内瘤变者(P<0.01),且两者均明显高于不伴上皮内瘤变者(P<0.05);溃疡性结肠炎组h TERT mRNA表达量明显高于正常对照组(P<0.05)。结直肠癌组h TERT mRNA表达量与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、术后复发及TNM分期呈正相关(P<0.05),与术后生存期呈负相关(P<0.05)。Cox多因素回归分析显示结直肠癌组织中h TERT mRNA表达量是影响术后预后的危险因素。结论结直肠癌组织中h TERT mRNA表达量与肿瘤重要病理特征相关,可成为评价结直肠癌术后预后的指标;结直肠腺瘤息肉和溃疡性结肠炎组织中h TERT mRNA高表达可能成为结直肠癌发生的预测指标。

外周血AFPmRNA、h-TERTmRNA检测对肝细胞肝癌患者预后的意义

目的检测肝细胞肝癌(HCC)患者外周血甲胎蛋白信使核糖核酸(AFPmRNA)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达,探索其在HCC预后中的应用价值。方法FQ-PCR检测60例HCC患者外周血中AFPmR-NA、hTERTmRNA的表达量,并与对照组进行比较。结果HCC患者AFPmRNA、hTERTmRNA的表达量及阳性率均高于对照组(P<0.01)。术后随着时间的推移,其表达数量相应减少,阳性率也明显降低,以1周后下降最为显著(P<0.05)。在肿瘤标志物持续表达阳性的患者中,其术后复发率也明显高于阴性者(P<0.01)。结论外周血中定量检测AFPmRNA、hTERTmRNA的表达可以及时发现患者术后HCC的微转移,预测肿瘤的复发倾向,为术后的合理治疗提供依据。

端粒酶逆转录酶在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探讨端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在胃癌组织中的表达并分析其临床意义。方法以实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测胃癌组织中hTERT mRNA的表达,同时用MaxVision^(TM)即用型快速免疫组化一步法检测胃癌组织中hTERT蛋白的表达,分析hTERT mRNA及其蛋白表达与胃癌临床病理参数之间的关系,并结合随访资料分析其与胃癌患者预后的关系。结果 hTERT mRNA在胃癌组织中的表达升高(P<0.05);hTERT蛋白在胃癌组织中的阳性表达率(83.3%)明显高于正常胃组织(40.0%)(P<0.05)。hTERT mRNA和蛋白表达水平呈正相关(r=0.733,P<0.05);hTERTmRNA的表达与淋巴结转移、远处转移及临床分期相关(P<0.05)。胃癌患者hTERT mRNA高表达组与低表达组的生存曲线存在明显差异(P=0.015)。结论 hTERT在胃癌组织中的表达升高,且和胃癌进展相关,可作为反映胃癌进展及预后的生物学指标。

宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨

目的了解宁夏地区黄牛博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的自然感染情况,对检测到的BDVp24基因阳性扩增片段进行核苷酸序列比对,探讨其与国际标准病毒株及其分离株的同源性。方法采用荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测宁夏地区205例健康牛外周血单个核细胞(PB-MCs)BDVp24基因片段,并对其中的阳性扩增产物进行基因序列测定,然后应用BLAST软件以及DNAsist5.0软件对测序结果分析。结果205例中3例阳性,阳性率为1.5%;该BDVp24片段的核苷酸序列与StrainH3915同源性最高达97.67%,与标准病毒株H1766同源性为96.51%,与StrainV/FR的同源性为95.35%,且它们编码的氨基酸相同。结论宁夏地区黄牛中存在动物源性BDV的自然感染,该BDVp24核苷酸序列与标准病毒株具有高度同源性。

肝癌患者血清端粒酶逆转录酶mRNA表达研究

【目的】探讨肝癌患者血清端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA表达水平及对肝癌的临床应用价值。【方法】设计人端粒酶逆转录酶基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系,在ABI7500实时荧光PCR仪上检测45例肝癌患者,52例病毒性肝炎患者,29例肝硬化患者和58例健康人血清端粒酶逆转录酶mRNA表达水平并分析其差异。【结果】肝癌患者血清hTERT mRNA水平明显高于肝炎、肝硬化患者及健康人。肝癌患者血清hTERT mRNA相对表达量与肿瘤大小和分化等级及分期明显相关,与年龄、性别、以及肿瘤数量无明显关联。【结论】肝癌患者血清hTERT基因表达上调,其升高程度与肿瘤分化与进展相关,检测血清hTERT基因表达水平有助于肝癌的诊断和研究。

宁夏地区绵羊博尔纳病病毒自然感染状况研究

目的探讨中国宁夏地区绵羊博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的自然感染状况,并分析比较中国宁夏地区绵羊自然感染BDVp24基因序列与国外人和动物来源BDV分离株及其标准株StrainV和He/80的同源性。方法采用巢式逆转录荧光定量PCR(FQ-nRT-PCR技术)检测了中国宁夏地区268例绵羊PBMCs中BDVp24基因片段,对阳性标本FQ-PCR产物进行基因序列测定,测序结果应用BLAST软件以及DNAsist5.0软件对测序结果分析,与国外人与动物来源的BDV分离株以及标准株StrainV和He/80进行序列比较。结果268例中4例绵羊外周血BDVp24基因片段阳性,阳性率为1.49%;测序分析结果表明,宁夏地区绵羊感染的BDVp24的核苷酸序列与马源性病毒株H3575同源性最近,同源性为98.84%(85/86),与标准株StrainV和He/80同源性为94.19%和100%。并且它们编码的氨基酸序列相同。结论宁夏地区绵羊中可能存在动物源性的BDV自然感染,该地区感染的BDVp24核苷酸序列与马源性病毒株H3575、标准株StrainV和He/80存在高度的同源性,其感染来源可能相同亦或存在相互之间感染的可能。

VEGF-C和FLT-4在非小细胞肺癌组织中的表达及其意义

目的研究VEGF-C、FLT-4在非小细胞肺癌组织中的表达及其与淋巴结转移的关系。方法采用半定量RT-PCR和免疫组化方法,检测60例非小细胞肺癌肿瘤组织中VEGF-C、FLT-4的表达。结果60例非小细胞肺癌组织中,36例(60%)VEGF-C阳性表达,30例(50%)FLT-4阳性表达。有淋巴结转移者VEGF-C和FLT-4的阳性表达率分别为80.5%和69.4%,明显高于淋巴结阴性组(29.2%和33.3%),有非常显著性差异(P值均<0.01)。经半定量RT-PCR分析,VEGF-C和FLT-4在有淋巴结转移者中的表达量明显高于无淋巴结转移者,有显著性差异(分别为P<0.01,P<0.05)。结论VEGF-C及其受体FLT-4的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移有关。

反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。

外周血免疫效应分子基因表达与移植物急性排斥的关系

目的 探讨5种免疫效应分子基因的表达与移植肾急性排斥的关系.方法 采用定量逆转录PCR（RT-PCR）方法动态测定急性排斥反应（AR） 组（n=22）、阴性对照组（n=22）肾移植患者移植外周淋巴细胞（PBL）的颗粒酶B、穿孔素、Fas、FasL和TIA-1的含量,判断其与急性排斥的关系.结果 肾移植术后出现急性排斥的患者各效应分子表达均明显增强,在排异初期与后期有明显的下降（P〈0.05）;各效应分子升高时间比临床上出现AR的症状早约2d,随着AR的逆转,其表达也逐渐降至原有基础水平.AR组与对照组在多个基因表达的联合分析可不同程度地提高敏感性和特异性,3种基因同时上调尤其有意义.结论 定量逆转录PCR（RT-PCR）方法测定外周血免疫效应分子基因的表达,是一种无创、较敏感的早期诊断肾移植急性排斥的方法,并可预测抗排斥反应治疗效果.