opaR基因缺失对AHPND致病菌生物学特性及毒力质粒接合转移的影响

急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)严重影响了我国乃至全球对虾养殖业的发展。近期研究发现,致病菌毒力质粒携带trb型Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion system, T4SS)可在高菌体密度下介导毒力质粒发生接合转移,从而导致AHPND致病菌多样性。为探究群体感应与T4SS表达以及毒力质粒接合转移的关系,本研究以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)群体感应系统的高密度调控子OpaR为研究对象,在致AHPND副溶血弧菌20130629002S01::cat(Vp2S01::cat)菌株基础上,利用同源重组技术构建opaR基因缺失株Vp2S01::catΔopaR。比较了出发菌株和缺失株在生长性能、运动性和生物被膜形成能力等方面的差异,分析了opaR基因对T4SS基因表达量以及质粒接合转移效率的影响。结果显示,opaR基因缺失不影响细菌的生长特性和群集运动,但泳动能力显著增加,生物被膜形成能力显著下降;接合转移实验显示,opaR基因缺失显著提高T4SS表达水平和接合转移效率。本研究为解析群体感应系统调控AHPND致病菌T4SS表达以及毒力质粒接合转移机制提供了基础数据,可为控制AHPND致病菌毒力质粒传播提供技术支撑。

副溶血弧菌OpaR转录调控元研究

文章旨在探究OpaR在生物膜形成条件下的转录调控机制。通过对野生型和opaR基因突变株的转录组数据进行比较,发现OpaR共调控了2243个基因的转录,其中1164个下调,1079个上调。功能富集分析结果显示,这些基因涉及分子功能、细胞组分、生物学过程等方面。代谢途径分析结果表明,差异表达基因主要涉及细胞代谢通路和环境信息处理。此外,从数据中还筛选出了多个与生物膜形成相关的基因。这些发现为理解OpaR调控生物膜形成的分子机制提供了重要信息和参考。

群体感应核心调控子OpaR和AphA对副溶血弧菌生物学功能及毒力基因调控的研究进展

群体感应(quorum sensing,QS)是细菌间一种常见的信号传递机制,可影响细菌的生物学功能与毒力基因表达。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)广泛分布于海洋环境中,是一种对全球水产养殖业产生严重影响的弧菌。OpaR和AphA是副溶血弧菌QS系统中的两个核心调控子,其中OpaR主要在高细胞密度(high cell density,HCD)下,AphA主要在低细胞密度(low cell density,LCD)下发挥调控作用。调控子OpaR和AphA参与生物膜形成、运动能力等多种生物学功能的调控,在副溶血弧菌致病过程中发挥重要作用。本文主要阐述了处于不同菌体密度时,副溶血弧菌QS核心调控子OpaR和AphA及相关基因转录表达情况,及其对菌体生物学功能与毒力基因表达调控情况,同时进一步从分子层面解析了副溶血弧菌的致病机制,以期为防控副溶血弧菌病提供参考。

副溶血弧菌lux报告基因系统的建立与应用

目的:建立副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,为后续研究基因转录调控机制奠定基础。方法:采用PCR扩增opaR的启动子区序列,并将其克隆入pBBRlux质粒中,构建重组质粒opaR-lux。将opaR-lux重组质粒分别转入野生株(WT)、opaR突变株(ΔopaR)和aphA突变株(ΔaphA)中,检测特定培养条件下三者发出的冷光值(Lux)以及在600 nm处的吸光度值(OD600),以“Lux/OD600”表示单位OD600下的相对平均冷光单位(relative light unit,RLU)。通过比较各菌株的RLU大小,判断OpaR和AphA对opaR的调控关系,以检验实验平台的稳定性。结果:成功构建出带有opaR的pBBRlux重组质粒;在低密度(OD600<0.4)时,AphA负调控opaR的转录,当细菌达到高密度(OD600=0.8)时,AphA则对opaR的转录不起调控作用;在细菌从低密度生长到高密度(即OD600<0.8)中,OpaR对自身的转录存在负调控作用。结论:成功建立了副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,用于后续转录调控机制的研究。

OpaR对副溶血弧菌pilABCD操纵子的调控研究

目的研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子OpaR对pilABCD的转录。方法提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和opaR突变株(ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究OpaR对pilA(pilABCD首基因)的转录调控;将pilABCD上游调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和ΔopaR中制备LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合试验研究OpaR对pilA的调控以及pilA的时相表达。提取WT株总RNA,采用引物延伸试验研究pilABCD的转录起始位点;PCR扩增pilABCD上游调控区DNA序列,并纯化His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究His-OpaR与靶DNA片段是否有直接的结合作用,并进一步采用DNaseⅠ足迹试验分析其结合位点。结果qPCR和LacZ报告基因融合试验显示OpaR对pilABCD的转录具有激活作用,pilA的表达水平随培养时间的延长而持续升高;引物延伸结果显示pilABCD只有一个转录起始位点T(-155);EMSA和DNaseⅠ足迹试验结果显示OpaR对位于pilA的翻译起始位点上游-246~-197 bp和-181~-131 bp之间的DNA序列具有结合活性。结论OpaR对pilABCD的转录具有直接的激活活性。

副溶血弧菌基因回补实验方法的建立与应用

目的建立以pBAD33质粒为载体的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)基因回补实验平台。方法 PCR扩增aphA和opaR的整个ORF区序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒中,构建重组质粒。分别将重组质粒转入到ΔopaR和ΔaphA中(分别代表opaR和aphA的突变株),以构建出相应的回补株C-ΔaphA和C-ΔopaR。分别在aphA和opaR基因内设计特异性引物,采用RT-PCR方法,验证在相应的回补突变株中aphA和opaR是否转录。利用引物延伸实验研究野生株(WT)、ΔopaR、ΔaphA、C-ΔaphA和C-ΔopaR中mfpA(aphA负调控,opaR正调控其表达)的相对RNA水平。结果 aphA和opaR在相应的回补株中发生转录;且mRNA水平与野生株一致。结论成功建立了以pBAD33质粒为载体的VP基因回补方法,并得到应用。

副溶血弧菌LacZ报告基因融合实验方法的建立与应用

目的:建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的LacZ报告基因融合实验方法。方法:PCR扩增靶基因的整个启动子区序列,并将其直接克隆入pHRP309质粒中,构建重组质粒;将重组质粒VPA1513转入VP野生株(WT)和opaR突变株(ΔopaR)中,而后通过比较两者β半乳糖苷酶活性的差异,确定OpaR对VPA1513的调控关系,以检验实验的稳定性。结果:构建出9个VP生物膜或毒力相关基因的LacZ重组质粒;OpaR对VPA1513的转录具有抑制作用。结论:建立了VP的LacZ报告基因融合实验方法,为后续转录调控机制的研究奠定了基础。

耳廓假性囊肿前壁切除术疗效观察

我科对耳廓假性囊肿采用前壁切除后局部打包加压治疗20例，现回顾总结其临床疗效，报道如下。 1资料与方法 1.1 临庥资料。我科2010年1月～2011年6N治疗耳廓假性囊肿20例（20耳），其中男18例，女2例；年龄27-69岁，平均43岁，病程2周～3个月，平均1个月。

评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型的建立与应用

目的建立评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型,并以此评价副溶血弧菌临床分离株RIMD2210633株与其重要致病相关基因opaR基因敲除株的毒力。方法以Raw-264细胞为靶细胞,RIMD2210633株及其opaR基因敲除株为效应细胞,通过优化条件,利用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay建立细胞模型。结果以5倍于靶细胞的菌量感染靶细胞,37℃孵育1.5 h,离心所得上清稀释10倍后,加底物液避光显色10 min,反应条件最佳。opaR基因敲除后,菌株的Raw-264细胞毒性升高,并有统计学差异。结论利用副溶血弧菌标准强毒株RIMD2210633菌株建立了评价副溶血弧菌毒力的RAW-264细胞模型,并利用此平台比较了该毒株与其opaR基因敲除株的毒力,为研究副溶血弧菌的致病机制奠定了基础。

前壁切除联合改良荷包缝合加压固定治疗复发及复杂性耳廓假性囊肿

耳廓假性囊肿是耳廓软骨间的无菌性浆液性渗出性炎症,常表现为耳廓表面出现一个半球形的无痛囊性隆起。目前对耳廓假性囊肿的临床治疗方法多样,缺乏统一,且多疗效欠佳,复发率较高,可遗留耳廓增厚、变形等后遗症[1]。本研究采用前壁切除联合改良荷包缝合加压固定术治疗复发及复杂性耳廓假性囊肿26例,取得满意疗效,现总结报道如下。

显微镜下耳廓假性囊肿切除术

总结2004年1月～2007年12月住院治疗的耳廓假性囊肿患者28例,均采用耳显微镜下手术切除,取得了很好的疗效,现报道如下。1资料与方法1.1临床资料。耳廓假性囊肿患者28例,男24例,女4例,年龄32～70岁。平均49岁,病程3个月～5年,平均7个月。表现为耳廓前上侧局限性隆起包块,有胀痒感,有些患者有轻微疼痛感;

耳廓前壁软骨切除与后壁软骨切除对耳廓假性囊肿术后的影响

耳廓假性囊肿是耳鼻咽喉科较为常见的一种疾病,是发生于耳廓软骨夹层内的非化脓性浆液性渗出所致的囊肿样隆起。因囊壁表面没有上皮细胞结构,故称耳廓假性囊肿。多为单耳发病,常位于耳廓腹侧上半部,隆起处可触及波动感但无压痛,穿刺可见淡黄色清亮液体,送检细菌培养无细菌生长。目前耳廓假性囊肿的发病机制尚不明确,有学者认为可能与局部受到机械性刺激引起局部循环受阻所致[1]。

手术开窗与石膏固定治疗耳廓假性囊肿的疗效比较

2005年以来在我院门诊诊治耳廓假性囊肿患者81例（81耳）,分别以手术开窗和石膏绷带固定进行治疗,现将治疗结果报道如下。1资料与方法临床资料。2005年1月～2010年9月经治的耳廓假性囊肿患者81例,其中2005年1月～2008年10月以石膏固定治疗为主,共49例;2008年12月～2010年9月以局部手术开窗治疗为主,共32例。全部患者均为单耳发病,其中男75例,女6例,年龄21～73岁,病程2 d～3个月。囊肿位于舟状窝42耳,三角窝28耳,耳甲艇4耳,耳甲腔7耳。

软骨部分切除治疗耳廓假性囊肿

耳廓假性囊肿指耳廓软骨夹层内的非化脓性浆液性囊肿，临床常见、多发。我科自2011年2月～2013年2月采用软骨部分切除治疗耳廓假性囊肿62例，效果满意报道如下。

髋关节置换术围手术期护理及康复护理研究

目的探讨髋关节置换术围手术期的护理、康复指导及训练要点。方法选取2011年8月-2014年8月本院收治的168例髋关节置换术患者,对其围手术期采取有针对性的护理、康复指导及训练。结果术后随访,168例患者均安全度过围手术期,未发生并发症,Harris评分优77例,良82例,中6例,差3例,髋关节置换术的优良率达94.6%。结论加强对髋关节置换术患者围手术期的护理、康复指导及训练,能有效预防并发症的发生,是手术成功及提高患者生活质量的关键。

企业如何有效进行成本管理

每个企业都应该有一套成本管理系统,成本管理主要包括成本预测,成本决策和成本控制,企业要想做好成本管理,就需要将以上三方面做好。虽然各个企业所属的市场环境以及经济部门不同,但其基本的成本管理思路是一致的。

太原汾河景区橡胶坝的运行管理和维护

太原汾河景区在二十年的治理美化工程中,围绕蓄水治理和防汛泄洪两大中心任务,选用了橡胶坝,进行了良好的布局、运行、管理和维护,充分发挥了它的性能优势,收获了很好的效益。这些显示了橡胶坝在水利工程中的优势和作用,景区运用的经验也可资全国其他相关水利工程建设借鉴。

氧化酶法肌酐测定的检测方法改良

目的：通过调整方法学参数改进现用肌酐试剂在日立7600-020生化分析仪上的测试性能。方法在日立7600-020生化分析仪上，将豪迈公司氧化酶法肌酐试剂进行方法改良，然后参照CLSI方法学评价相关文件进行评估，具体指标有准确度、精密度、干扰试验、线性范围和参考区间。结果通过方法改良的肌酐测试系统性能指标为：偏倚（bias）是2.51%；批内不精密度（CVw）为2.43%；批间不精密度（CVb）为3.05%；线性范围为33-9105 umol/L；干扰试验，改良法优于原法；参考区间两种方法相符合。结论通过改良的肌酐测试系统优于原方法学系统。

汽车发动机缸体数控加工的一种方法

针对汽车发动机缸体激光淬火加工提出了一种数控加工方法，该法实现了缸体激光淬火的自动控制过程，采用计算机数控技术实现其硬化发动机缸体内表面的效果。它可选择多种形式的网纹，平均加工一个缸体仅用１０ｍｉｎ以下，缩短了工时，提高了汽车缸体加工的科学性。

不同遗传背景下QsvR调控副溶血弧菌基因表达的转录组分析

【背景】OpaR是副溶血弧菌群体感应系统的核心调控因子;QsvR是AraC家族转录调控因子,与OpaR之间具有相互调控作用;此外,QsvR对基因表达的调控作用受OpaR的影响,但是影响程度并未完全阐明。【目的】探究在野生株(wild-type,WT)和opaR基因突变株(ΔopaR)的遗传背景下QsvR的转录调控元,分析Opa R对QsvR基因表达调控的影响。【方法】分别以WT和ΔopaR为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行比较转录组学研究,分析生物膜形成条件下qsv R基因突变株(Δqsv R)和Δqsv RΔopaR的基因表达情况。【结果】在WT遗传背景下,QsvR共调控1735个基因的转录(调控元1),其中被激活的基因有855个,被抑制的基因有880个;在ΔopaR遗传背景下,QsvR共调控1 187个基因的转录(调控元2),其中被激活的基因有533个,被抑制的基因有654个。调控元1和调控元2之间共有517个重叠基因,且QsvR对绝大多数重叠基因的调控关系相反。基因属性分类(gene ontology, GO)数据库富集分析结果显示,调控元1和调控元2中分别有467个和204个基因注释到分子功能、细胞组分和生物学过程3个一级分类和30个二级分类;京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)对代谢途径的分析结果显示,调控元1和调控元2中分别有372和678个基因归到30个代谢通路中(Q value<0.05),调控元1中的基因主要集中在代谢、基因信息处理和环境信息处理上,而调控元2中的基因主要集中在细胞代谢通路上。蛋白相邻类的聚簇(cluster of orthologous groups of proteins, COG)数据库分类结果显示,调控元1和调控元2中的基因主要涉及氨基酸转运与代谢、信号转导、能量产生与转换、一般功能预测基因和未知功能基因等。此外,调控元1和调控元2中还含有大量调控因子基因和推定的c-di-GMP代谢基因,以及若干极生鞭毛基因、荚膜多糖基因、胞外多糖合成基因、Ⅳ型菌毛合成基因、Ⅲ型分泌系统基因和Ⅵ型分泌系统基因等。【结论】QsvR是副溶血弧菌中的全局性调控因子,控制着大量基因的转录。QsvR对靶基因的调控关系及QsvR调控元组成均受OpaR的影响。