基于oppD/F基因的牛支原体贵州株分子生物学鉴定

为了确定疑似牛支原体(Mb)肺炎病例病原种类,试验采用分子克隆技术对牛支原体贵州流行株oppD/F基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明:所合成引物从支原体分离培养物中扩增出大小约为1 912 bp基因片段,与预期oppD/F基因片段的大小相符,其测序序列与Gen Bank数据库中参考株核苷酸同源性为42.6%~99.8%,与标准株核苷酸同源性为99.6%,与从发病动物中分离得到的内蒙株和湖北株同源性最高(均达到99.8%),与其他途径分离得到的参考菌株同源性都很低;系统进化树分析显示,牛支原体贵州分离株与标准参考株在同一进化分支上,与临床易混淆的丝状支原体丝状亚种存在明显差异。说明此次从疑似牛支原体肺炎病例中分离培养的支原体确为牛支原体。

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列(登录号:AF130119.1)设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(61.78%),无规则卷曲次之(20.78%)。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。

新疆不同地区牛支原体分离株oppD/F基因的克隆和序列分析

为研究新疆不同地区牛支原体分离株oppD／F基因的遗传特性，从哈密、塔城等新疆不同地区的规模化奶牛场采集了疑似牛支原体感染的病死奶牛肺脏组织、关节液及鼻拭子。对病料进行病原分离，PCR检测特异性基因op—pD／F及序列分析。结果显示，固体培养基上得到典型的“煎蛋状”菌落，并扩增出448bp特异性目的条带。生物信息学分析显示，24株新疆不同地区分离株间核苷酸和氨基酸序列同源性均较高，与国际标准株PG45（CP002188．1）氨基酸序列同源性为97．3％～100．0％，具有高度同源性。研究结果为新疆地区牛支原体流行病学分子信息及免疫预防提供理论依据。

牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用

为快速确诊肉牛牛支原体病,根据牛支原体 OPPD/F 基因序列设计1对引物,通过反应条件的优化,建立牛支原体PCR诊断方法。结果表明:该方法可从牛肺、鼻拭子临床样本和其临床样本的培养物中直接检测到牛支原体病病原核酸,该方法可检测的病原核酸最小浓度约为1×10^-7 μg,整个检测过程仅需3.5 h。该方法具有快速、灵敏性高、特异性强等特点,对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义。

牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速检测牛支原体(Mycoplasma bovis)的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank中收录的牛支原体OPPD/F基因序列(登录号:AF130119),利用Primer 5.0软件设计特异性引物与TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,构建检测牛支原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.994,扩增效率E=1.280。荧光定量PCR法检测的敏感性是常规PCR的10倍;特异性良好,检测9种相关细菌和病毒均为阴性;重复性好,组内及组间样本检测Ct值均小于2%。牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法较之于常规PCR方法有快速、特异性强、敏感性高、稳定性好的优点。