SB431542和TGF-β_1对甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞α-SMA及CTGF基因表达的影响

目的探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和SB431542（TGF-β1受体酶抑制剂）对甲状腺相关性眼病（thyroid-associated ophthalmopathy,TAO）患者眼眶成纤维细胞α平滑肌激动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）基因表达的影响,为TAO眼外肌纤维化的治疗寻找潜在的药物治疗靶点。方法实验分为3组。第1组：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time PCR,RT-PCR）检测不同浓度TGF-β1（0μg·L-1、1μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1）刺激TAO患者眼眶成纤维细胞后α-SMA及CTGF mRNA的表达情况;第2组：采用RT-PCR检测10μg·L-1 TGF-β1在不同的时间点（0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）刺激TAO患者眼眶成纤维细胞后α-SMA及CTGF mRNA的表达情况;第3组（分为4小组处理）：眼眶成纤维细胞不加任何干预、使用30μmol·L-1SB431542刺激眼眶成纤维细胞、10μg·L-1 TGF-β1单独刺激眼眶成纤维细胞、30μmol·L-1 SB431542联合10μg·L-1 TGF-β1刺激眼眶成纤维细胞（SB431542预先刺激眼眶成纤维细胞1 h,然后再加入TGF-β1）,采用RT-PCR检测α-SMA及CTGF mRNA的表达。结果TGF-β1在一定的浓度范围内（1~10μg·L-1）以剂量依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA及CTGF mRNA,随着浓度增加mRNA表达增加,各浓度组（1μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1）与空白对照组（0μg·L-1）相比,差异均有统计学意义（均为P〈0.05）。TGF-β1在一定的时间范围内（0~24 h）以时间依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA及CTGF mRNA,随着时间延长mRNA表达增加,各时间组（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）与0 h相比,差异均有统计学意义（均为P〈0.05）。10μg·L-1的TGF-β1诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA在24 h达到峰值,而CTGF mRNA在12 h即可达到峰值。SB431542对眼眶成纤维细胞α-SMA mRNA及CTGF mRNA的表达均有抑制作用。结论一定范围内,TGF-β1以剂量和时间依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞α-SMA及CTGF mRNA的表达,SB431542可抑制其表达。

TGF-β_1对甲状腺相关性眼病眼外肌成纤维细胞Smads基因表达的影响

目的:测定转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)患者纤维化眼外肌来源的成纤维细胞(orbital fibroblasts,OF)细胞Smad3,Smad4,Smad7基因表达的影响。方法:采用实时荧光定量逆转录聚合酶连反应(real-time quantitative RT-PCR)观察5μg/L TGF-β1刺激OF在不同时间点(0h;15,30min;1,2,4h)表达Smad3 mRNA,Smad4 mRNA,Smad7 mRNA的变化。结果:5μg/L TGF-β1刺激OF 15min后,Smad3 mRNA的表达量已显著增加,为对照组的10.71倍,于1h达顶峰,为对照组的25.07倍(P<0.01),持续近2h,然后呈下降趋势,4h基本恢复正常;5μg/L TGF-β1刺激OF 15min后,Smad4 mRNA的表达量开始增加,为对照组的1.54倍,于1h达顶峰,为对照组的15.99倍(P<0.01),然后呈下降趋势,4h基本恢复正常;5μg/L TGF-β1刺激OF30min后,Smad7 mRNA的表达量明显开始增加,为对照组的3.21倍,持续至4h为对照组的14.66倍(P<0.01)。结论:TGF-β1可活化眼眶成纤维细胞Smads信号通路。在一定的时间范围内,诱导OF表达Smad3 mRNA和Smad4 mRNA呈先增加后下降的趋势,而Smad7 mRNA表达则呈现持续增加的趋势,说明TGF-β1/Smads这一纤维化相关的经典信号转导通路可能在TAO眼外肌纤维化机制中发挥了重要的作用。

胰岛素样生长因子-1对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的促生长作用

背景甲状腺相关眼病（TAO）是一种自身免疫性疾病，目前对其发病机制的研究主要集中在共同抗原上。胰岛素样生长因子-1（IGF．1）功能的发挥需要IGF-1受体（IGF-1R）的参与，IGF-1在促甲状腺激素受体（TSHR）的信号传导通路中也起着重要作用。目的探讨IGF-1对TAO患者眼眶成纤维细胞（OFs）增生及IGF-1R、TSHR表达的影响，探讨IGF-1在TAO发病机制中的作用。方法收集2016年3-6月于四川大学华西医院行TAO眼眶脂肪切除术取得的眶组织标本17例17份及正常人美容手术取得的眼眶组织4人4份，采用含体积分数5％胎牛血清的DMEM／F12培养液培养OFs。分别于培养液中加入不同质量浓度（O、50、100、125μg／L）的IGF-1，采用MTS比色法绘制OFs生长曲线，评估IGF-1对TAO和正常来源OFs增生的影响；采用流式细胞术测定不同质量浓度IGF-1对TAO和正常来源OFs中IGF-1R、TSHR表达水平的影响。结果TAO患者与正常人来源的OFs均生长良好，呈梭形，细胞质丰富，TAO患者与正常人来源的OFs形态学特点一致。培养的OFs波形蛋白呈阳性反应，结蛋白、S-100、肌红蛋白和角蛋白均呈阴性反应。不同质量浓度IGF-1作用后TAO组和正常组OFs增生均呈逐渐上升趋势，总体比较差异有统计学意义（F分组=219．639，P〈0．001；F质量浓度=17．752，P〈0．001），以100μg／LIGF-1的促进作用最强。0、50、100、125μg／LIGF-1作用后TAO组OFs中IGF-1R表达量分别为（0．0091±0．0087）％、（0．0953±0．0233）％、（0．0837±0．0227）％和（0．0709±0．0241）％，正常组OFs中IGF-1R表达量分别为（0．0023±0．0006）％、（0．0093±0．0012）％、（0．0073±0．0015）％和（0．0083±0．0012）％，其中50、100和125μg／LIGF-1作用后各组OFs中IGF-1R表达量均高于无添加IGF-1者，TAO组OFs细胞中IGF-1R的表达量均明显高于正常组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）；0、50、100和125μg／LIGF-1作用后TAO组和正常组OFs中TSHR表达量的总体比较差异均无统计学意义（F分组=0．133，P〉0．05；F质量浓度=0．004，P〉0．05）。结论IGF-1对TAO患者和正常人OFs的生长均有促进作用并能上调OFs中IGF-1R的表达，但其对OFs中TSHR的表达变化无明显影响。

穿透素3对转化生长因子β1诱导的眼眶成纤维细胞纤维化的影响

目的探索穿透素3(PTX3)对TGF-β诱导的眼眶成纤维细胞(OF)纤维化的作用。方法以体外培养的甲状腺相关眼病(TAO)患者来源及健康来源OF为研究对象,在培养液中加入人重组PTX3(rhPTX3)蛋白(1μg/mL)及重组TGF-β1(10 ng/mL)进行刺激,刺激完成后选择特异性抗体标记细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),通过免疫荧光显微镜观察OF的纤维化程度变化。给予细胞相同的刺激,刺激后通过qRT-PCR检测细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白α1(Col Iα1)、IL-6 mRNA表达量的变化。结果TGF-β1可诱导两组OF中α-SMA蛋白表达量增加,细胞呈现纤维化改变,而rhPTX3对该效应未见明显抑制作用。TAO患者来源OF的纤维化效应较健康来源OF无明显差异。TGF-β1可诱导OF纤维化相关蛋白(α-SMA、Col Iα1、IL-6)mRNA表达上调。rhPTX3对OF中α-SMA mRNA的表达无明显诱导作用,但共刺激时可增强TGF-β1对α-SMA mRNA的上调效应。rhPTX3可上调Col Iα1和IL-6 mRNA的表达,共刺激时可增强TGF-β1对IL-6 mRNA的诱导上调,但对Col Iα1 mRNA的上调未见明显影响。结论rhPTX3对TGF-β1诱导的OF纤维化过程具有潜在的促进作用,说明PTX3可能参与了TAO患者后期视物重影的发病过程,并发挥了正向作用。

秋水仙碱对甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞增生的影响

背景甲状腺相关眼病（TAO）患者的眼眶成纤维细胞（OFs）在眼部的增生性和炎症性反应中发挥重要作用，寻求抑制OFs增生的药物对TAO的防治具有重要意义。已有研究表明，秋水仙碱具有抗组织纤维化的作用，但其对TAO患者OFs的作用及其机制研究较少。目的研究秋水仙碱对体外培养的OFs增生的影响。方法将3例TAO患者行开眶减压术中获取的球后结缔组织用组织块培养法进行培养和鉴定，取3-8代的传代细胞进行体外实验。分别将1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol／L秋水仙碱加入含质量分数10％小牛血清的RPMI1640培养基中孵育OFs24、48和72h，用无秋水仙碱的RPMI1640培养基孵育细胞作为对照，采用细胞计数试剂盒．8（CCK-8）检测各组细胞450nm处的吸光度（A450）值，评估OFs的生长情况和各浓度组秋水仙碱对OFs的抑制率。此外，分别在培养基中加入1×10-6、1×10-6、1×10-4mol／L秋水仙碱作用48h，采用流式细胞术及应用MCYCLE软件进行分析，用百分率记录亚二倍体细胞数据及细胞周期各时期数据，检测各浓度药物组及无药物培养基组OFs的凋亡率和细胞周期的分布；采用免疫组织化学染色法测定转化生长因子-β（TGF-β）在OFs中的表达，以评价不同浓度秋水仙碱对OFs分泌TGF-β功能的影响。结果培养和传代的OFs呈梭形，波形蛋白免疫化学染色为阳性反应。1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol／L秋水仙碱作用24、48和72h，随着秋水仙碱浓度的增加，OFs的增生值（A450）逐渐下降，差异有统计学意义（F浓度=62．004，P〈0．05）；此外，随着秋水仙碱作用时间的增加，A450值逐渐下降，差异有统计学意义（F时间=459．582，P〈0．05）；随着秋水仙碱浓度的增加，其对OFs生长的抑制率逐渐升高。对照组、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol／L秋水仙碱组OFs凋亡率分别为（1．73±0．15）％、（21．04±4．56）％、（31．84±6．21）％和（35．32±5．56）％，4个组间差异有统计学意义（F=83．905，P〈0．05），各组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；随着秋水仙碱浓度的增加，G2＋M期细胞百分数逐渐下降，差异有统计学意义（F=20．443，P〈O．05）。免疫组织化学法检测发现，在融合状态前的OFs可以分泌TGF-β，阳性率为（97．60±2．09）％，而1×10-4mol／L秋水仙碱作用后OFs密度明显减低，部分OFs阳性率为（44．43±3．96）％，差异有统计学意义（t=65．330，P〈0．05）。结论秋水仙碱可能通过减少OFs分泌TGF-β抑制TAO患者OFs的增生并诱导OFs的凋亡，其作用呈时间和剂量依赖性。