青虾(Macrobrachium nipponense)Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子基因全长cDNA的克隆及表达

采用RACE技术,首次从青虾精巢中克隆得到KSPI基因全长cDNA。青虾KSPI基因cDNA全长890bp,包括80bp的5′UTR,546bp的3′UTR和编码87个氨基酸残基的264bp开放阅读框。预测蛋白包含1个保守的Kazal型结构域(CⅠX5CⅡX(6)VCⅢX(5)TYXNXCⅣX6CⅤX12CⅥ),结构域中P1活性位点为苏氨酸残基。应用MEGA4.1软件对青虾与已报道的虾类共15种KSPI氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明,青虾KSPI与同样来源于精巢的罗氏沼虾KSPI进化关系最近聚为一支,其它虾类来源于肝胰腺和血细胞的KSPI聚为另外两支。采用定量PCR技术分析其组织分布,结果显示,KSPI基因在精巢、心脏和卵巢中有较高表达,其中精巢表达水平极高,并与心脏和卵巢表达差异分别达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平,其它组织表达较弱。

鱼粉蛋白与发酵酶解豆粕蛋白不同配比对日本沼虾生长及免疫性能的影响

本试验旨在评价补充微囊氨基酸条件下鱼粉蛋白和发酵酶解豆粕蛋白不同配比对日本沼虾生长和免疫性能的影响。试验配制5组等氮等能饲料,以发酵酶解豆粕分别替代饲料中0(FM组)、25%(R25组)、50%(R50组)、75%(R75组)以及100%的鱼粉(R100组)(鱼粉蛋白与发酵酶解豆粕蛋白配比分别为1∶0、3∶1、1∶1、1∶3和0∶1),对平均体重为(0.103 0±0.000 2)g的日本沼虾进行8周的饲养试验,随后对各组虾进行嗜水气单胞菌感染试验。每组设5个重复,每个重复50尾虾。结果表明:当鱼粉蛋白与发酵酶解豆粕蛋白配比为1∶1时,日本沼虾的增重率达到最大,显著高于FM和R100组(P<0.05),各组日本沼虾的存活率无显著差异(P>0.05);各组日本沼虾的肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量无显著差异(P>0.05);FM组日本沼虾的血细胞总数及血淋巴吞噬活性均显著高于R100组(P<0.05);肝胰腺中热应激同源蛋白70和热应激蛋白90的mRNA相对表达水平分别在FM和R25组达到最高,显著高于其余各组(P<0.05);当发酵酶解豆粕替代鱼粉比例超过50%时,嗜水气单胞菌感染后日本沼虾的累计死亡率显著增加(P<0.05)。由此可见,发酵酶解豆粕可作为日本沼虾饲料中较好的蛋白质源,在氨基酸平衡条件下鱼粉蛋白和发酵酶解豆粕蛋白的最佳配比为1∶1。

应用SSR和SRAP标记构建青虾遗传连锁图谱

采用SSR和SRAP标记结合拟测交策略构建青虾（Macrobrachium nipponense）遗传连锁图谱。共有175个标记（含27个SSR、148个SRAP标记）分布在53个连锁群上。每个连锁群含2~8个标记,其中不少于3个标记的连锁群有35个,连锁对18个,平均每个连锁群的标记数为3.3个;连锁群长度在6.7~91.2 cM之间,相邻标记间最大间隔为49.0 cM,最小为1.4 cM,平均间隔为13.1 cM。青虾框架图谱长度为997.2 cM,图谱观察总长度为2 270.5cM,根据估算,青虾遗传连锁图谱预期长度为4 380.6 cM,图谱的覆盖率为51.83%。本研究构建了青虾遗传连锁图谱,该图谱也是淡水虾蟹类第一张遗传连锁图谱,可为青虾QTL定位、基因克隆、遗传选育等提供指导,并为进一步构建高密度的青虾遗传连锁图谱奠定了基础。

杂交青虾“太湖1号”肌肉营养成分分析

本试验以池塘养殖太湖青虾为对照,对杂交青虾"太湖1号"营养成分进行了分析。结果显示:杂交青虾"太湖1号"肌肉的水分、粗灰分、粗脂肪、粗蛋白含量与对照组差异不显著(P>0.05)。实验组与对照组氨基酸总量分别为79.5%和80.84%,差异不显著(P>0.05);必需氨基酸指数(EAAI)分别为66.32%和66.94%,构成比例符合联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)的标准,差异不显著(P>0.05);脂肪酸中EPA和DHA总量分别为0.83%和1.74%,差异不显著(P>0.05);主要微量元素比例合理,与对照组差异不显著(P>0.05)。研究表明,杂交青虾"太湖1号"肌肉主要营养成分与太湖青虾基本一致,两者没有显著差异。

青虾种质资源研究与保护进展

为了有效开展长江中下游地区青虾规模化养殖等工作。本研究简要总结青虾基础生物学、生化组成、细胞遗传学、生化遗传学、分子遗传学及基因组学等方面的主要研究成果,并对青虾种质资源的保护利用提出了一些意见。旨在为青虾种质资源的合理利用和保护提参考资料。

饲料亚麻酸含量对日本沼虾生长、抗氧化能力、非特异性免疫性能及抗氨氮胁迫能力的影响

亚麻酸(C18∶3n-3,LNA)作为一种重要的多不饱和脂肪酸,对甲壳动物生长、免疫保护和抵抗环境胁迫具有重要的调节作用。本试验旨在研究饲料LNA含量对日本沼虾生长、抗氧化能力、非特异性免疫性能和抗氨氮胁迫能力的影响,探讨日本沼虾饲料中适宜的LNA含量。试验配制LNA含量分别为0(L0,对照)、0.5%(L0.5)、1.0%(L1.0)、1.5%(L1.5)、2.0%(L2.0)和2.5%(L2.5)的6种等氮等脂的半纯化饲料,饲喂初始体重为(0.12±0.01)g日本沼虾幼虾8周。每种饲料投喂5个水族箱(重复),每个水族箱放养50尾试验鱼。饲养试验结束后,从每个水族箱选取10尾试验鱼进行24 h氨氮(水体总氨氮浓度为36.6 mg/L)胁迫试验。结果表明:日本沼虾特定生长率、增重率和存活率均随饲料LNA含量的增加呈先升后降的趋势,但组间差异不显著(P>0.05)。LNA的含量在肝胰腺和肌肉中都随饲料LNA含量的增加而增加。随着饲料中LNA含量的增加,日本沼虾肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和总抗氧化能力(T-AOC)基本呈现先升后降的趋势,且均在L1.0组达到最高值。L0.5、L1.0、L1.5、L2.0和L2.5组肝胰腺丙二醛(MDA)含量显著低于L0组(P<0.05)。肝胰腺碱性磷酸酶(ACP)活力以L1.0组最高,但L1.0和L1.5组之间不存在显著性差异(P>0.05)。随着饲料LNA含量的增加,肝胰腺溶菌酶(LYZ)活力呈先升后降的趋势,在L1.5组达到最高,显著高于其他各组(P<0.05)。24 h氨氮胁迫后,L0.5、L1.5、L2.0、L2.5组的肝胰腺M DA含量显著低于L0组(P<0.05),且以L1.5组M DA含量最低,显著低于其余各组(P<0.05);肝胰腺SOD活力和T-AOC随着饲料LNA含量的增加呈先上升后下降趋势,L1.5组SOD活力达到最高,L1.0组T-AOC达到最高;肝胰腺GSH-Px活力以L0组最高,但与L1.0组差异不显著(P>0.05)。以肝胰腺SOD活力为指标,经二次回归分析得出日本沼虾的LNA需要量为1.19%。综上,饲料中适宜的LNA含量(1.0%~1.5%)能改善日本沼虾的生长,增强其抗氧化能力和非特异性免疫性能,缓解氨氮胁迫对其造成的负面影响。

洮湖日本沼虾遗传多样性的RAPD和SSR分析

利用RAPD技术和微卫星(SSR)技术对洮湖日本沼虾群体的遗传多样性进行了分析。RAPD分析结果表明,每个随机引物扩增出3～8条带,片段大小在100～1 000 bp之间,17个引物共扩增出95条清晰条带;其中48条表现为多态,多态位点比例为16.67%～66.67%,群体遗传杂合度为0.196 0,Shannon多样性指数为0.257 6。微卫星分析结果表明,5个微卫星基因座共检测到50个等位基因,群体平均观测杂合度为0.742 5,平均期望杂合度为0.776 6,平均多态信息含量为0.574 0。2种研究结果表明,洮湖日本沼虾种质资源状况良好,遗传多样性较丰富。

饲料糖脂比对日本沼虾生长性能及肝胰腺代谢酶活性、脂肪酸转运和Toll样受体通路相关基因表达的影响

本试验旨在研究饲料糖脂比对日本沼虾生长性能及肝胰腺代谢酶活性、脂肪酸转运和Toll样受体通路相关基因表达的影响。配制糖脂比分别为1. 12 (CL1)、2. 00 (CL2)、3. 56(CL3)、7.10(CL4)、24.12(CL5)的5种等氮(粗蛋白质含量为39%)试验饲料,对日本沼虾[(0.104±0.003) g]进行为期8周的饲养试验。将试验虾随机分为5组,每组5个重复,每个重复50只。结果显示:当糖脂比从1.12增加到7.10时,日本沼虾增重率变化不显著(P>0.05),但糖脂比继续增加到24.12时,日本沼虾增重率显著降低(P<0.05);各组日本沼虾的存活率无显著差异(P>0.05); CL5组肝胰腺糖原含量显著高于CL4组(P<0.05); CL4组肝胰腺己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性最高,其HK活性显著高于CL1组(P<0.05),PK活性显著高于其余各组(P <0. 05);肝胰腺中丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)活性在各组间未表现出显著差异(P>0.05),但CL1和CL2组肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于CL4和CL5组(P<0.05); CL1组肝胰腺中B类Ⅰ型清道夫受体(SR-BI)和脂肪酸转运蛋白4(FATP4)基因的表达水平显著高于其余各组(P<0.05),但较高糖脂比组(CL4组)肝胰腺中脂肪酸结合蛋白10 (FABP10)基因的表达水平显著高于较低糖脂比组(CL1、CL2和CL3组)(P <0.05); CL3组肝胰腺中Toll样受体3(TLR3)、髓样分化蛋白88(MyD88)、白细胞介素1受体相关激酶4(IRAK4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)和丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)基因的表达水平显著高于其余各组(P<0.05)。由此可见,日本沼虾对饲料糖脂比有较大的适应性,但过高的糖脂比(24.12)会抑制其生长,增加肝糖原的累积;饲料糖脂比可调节日本沼虾肝胰腺脂肪酸转运和Toll样受体通路相关的表达。

磷脂影响日本沼虾对饲料中脂肪的需要量

本试验旨在探讨饲料中磷脂对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)脂肪需要量的影响。选取初始体重为(0.075±0.001)g的日本沼虾为试验对象,在室内养殖缸中进行为期8周的生长试验。将鱼油和豆油等比例混合均匀,再与大豆磷脂分别按2∶1和1∶2混合,使得大豆磷脂分别占脂类混合物的33.3%(低磷脂组)和66.7%(高磷脂组)。将2种脂类混合物分别按3%(低脂肪组)、6%(中脂肪组)、9%(高脂肪组)的比例添加到饲料中,配制出6种等氮等能的试验饲料。根据试验饲料中脂类混合物添加量和大豆磷脂添加量,将6种试验饲料分别命名为L3P1、L3P2、L6P2、L6P4、L9P3、L9P6,实测试验饲料中脂肪水平分别为7%、7%、10%、10%、13%、13%。每种试验饲料投喂4缸试验虾,每缸放养150尾。结果表明:6组日本沼虾的成活率在47.8%~66.9%,以L6P4组成活率最高,其次是L3P2组,以L9P3组最低。高脂肪组的终末体重、增重率、特定生长率和成活率显著低于中、低脂肪组(P<0.05),饲料系数显著高于中、低脂肪组(P<0.05)。高磷脂组终末体重、增重率、特定生长率和成活率显著高于低磷脂组(P<0.05),饲料系数显著低于低磷脂组(P<0.05)。脂类混合物添加量和大豆磷脂比例对各生长性能指标均有显著的交互作用(P<0.05)。虾体粗脂肪含量随着饲料脂肪水平的升高而显著升高(P<0.05),但高磷脂组虾体粗脂肪含量显著低于低磷脂组(P<0.05)。高脂肪组肝胰腺类胰蛋白酶和脂肪酶活性显著低于中、低脂肪组(P<0.05);高磷脂组肝胰腺脂肪酶活性显著高于低磷脂组(P<0.05)。脂类混合物添加量和大豆磷脂比例对肝胰腺脂肪酶活性有显著的交互作用(P<0.05)。脂类混合物添加量对肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)有显著影响(P<0.05),而大豆磷脂比例对二者无显著影响(P>0.05),但脂类混合物添加量和大豆磷脂比例对肝胰腺T-AOC有显著的交互作用(P<0.05)。上述结果提示,日本沼虾饲料中磷脂应与脂肪保持一定的比例。根据本试验结果,饲料中脂肪水平为10%、大豆磷脂添加量为4%时对日本沼虾比较适宜。

杂交青虾“太湖1号”与日本沼虾养殖性能的比较

试验以肥满度、平均规格、饲料系数、生长速度等生长性能指标,pH值、溶解氧、氨态氮、亚硝态氮等水质指标为依据,比较"太湖1号"F1及F2代与日本沼虾的生长性能。结果显示,饲料系数从低到高依次为:"太湖1号"F1<日本沼虾<"太湖1号"F2,其中F1和F2差异显著(P<0.05)。平均规格及上市成虾比例从高到低依次为:"太湖1号"F1>"太湖1号"F2>日本沼虾,其中F1代显著高于日本沼虾(P<0.05)。"太湖1号"的肥满度与日本沼虾差异不明显。9—10月吃食旺盛季节,杂交青虾"太湖1号"的体质量与体长均高于日本沼虾,其中,F1代达到显著水平(P<0.05),但体质量与体长的瞬时增长率优势不明显。9—10月份"太湖1号"F1养殖池的氨态氮、亚硝态氮等水质指标显著低于F2和日本沼虾池,而溶解氧与pH值的差异不大。养殖效益分析表明,尽管杂交青虾的增产优势不明显,但因其规格大,销售价格高,其产值与净利润仍高于日本沼虾,且F1代达到显著水平(P<0.05)。所以,杂交青虾"太湖1号"F1代的养殖性能显著优于日本沼虾,但F2代的生长优势不明显。

不同途径感染白斑综合征病毒(WSSV)对日本沼虾的致病性

日本沼虾肉质鲜美、经济价值高,但其对白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的易感性尚不明确。采用流行病学调查、感染试验和荧光定量PCR(qPCR)等方法,研究了日本沼虾Macrobrachium nipponense对WSSV的易感性、感染发病率以及WSSV在其体内的增殖情况。结果表明:日本沼虾是WSSV的自然宿主,上海市附近省份地区120个样本的自然携带率为8.33%。日本沼虾可以通过注射、摄食、浸泡途径感染WSSV,10 d内累计感染率均为100%,累计死亡率分别为100%、75%和0%。其中注射途径感染日本沼虾,感染后5 d肌肉病毒含量达到感染后1 d的1 000倍,8 d死亡率达100%。用注射WSSV感染日本沼虾死亡率来测量病毒致死日本沼虾的半数致死剂量(LD_(50)),2.71×10~5病毒粒子/μL能使日本沼虾死亡率达到50%以上。在养殖生产中,日本沼虾可以通过摄食感染WSSV的病虾或死虾而感染WSSV,也能通过浸泡在含WSSV的水体中而感染,并因此成为一种传播媒介,从而影响了WSSV的迅速传播与致病。