成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系。本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证。方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),多聚腺苷酸化和5′连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR4-TOPO载体上得到大约109bpDNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况。根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证。结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166)。选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达。结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系。

microRNA-192抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-192抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-192抑制物(hsa-miR-192inhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-192的活性。结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01)。随着浓度从50nmol/L逐渐增加至200nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01)。与对照组相比,实验组细胞周期G_0/G_1细胞比例显著增加,G_2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少(P<0.01)。实验组凋亡率(13.6±2.1)%与阴性对照组凋亡率(7.1±0.5)%相比明显增高(P<0.01)。结论:miR-192抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-192的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用,可能成为骨肉瘤生物治疗的新靶点。

tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用

目的:观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用。方法:采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变。MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡。电镜观察呈现出典型的凋亡特征。MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制。Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞(凋亡率为6%)相比,其凋亡率为35.8%。结论:tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。

端锚聚合酶抑制剂XAV939抑制人骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖及作用机制研究

目的:研究端锚聚合酶抑制剂XAV939对人骨肉瘤SOSP-9607细胞增殖的抑制及其作用机制。方法:以人骨肉瘤SOSP-9607细胞为研究对象,采用CCK-8法测定0.5、1、5、10μmol/L XAV939分别作用24、48、72 h后的细胞增殖情况,并计算细胞抑制率;采用流式细胞术检测5μmol/L XAV939作用72 h后的细胞凋亡情况及周期分布;以甘油醛-3-硫酸脱氢酶(GAPDH)为内参,采用蛋白质印迹法测定0.5、1、5、10μmol/L XAV939作用72 h后细胞中β-联蛋白(β-catenin)、G1/S期特异性周期蛋白D1(Cyclin D1)和基质金属蛋白酶7(MMP-7)的相对表达量。结果:1μmol/L XAV939作用72 h后,5、10μmol/L XAV939作用24、48、72 h后,SOSP-9607细胞的抑制率均显著升高(P<0.05或P<0.01)。5μmol/L XAV939作用72 h后,SOSP-9607细胞的凋亡率从3.71%上升至21.03%(P<0.05);G1期细胞的比例由45.5%增至54.8%,S期细胞的比例由27.4%降至24.0%,G2/M期细胞的比例由22.2%降至16.2%(P<0.05)。5、10μmol/L XAV939作用72 h后,SOSP-9607细胞中β-catenin、Cyclin D1和MMP-7的相对表达量均显著下降(P<0.05或P<0.01)。结论:端锚聚合酶抑制剂XAV939能够抑制人骨肉瘤SOSP-9607细胞的增殖,其机制可能与其将细胞周期阻滞于G1期、阻断细胞外因子(Wnt)/β-catenin信号通路有关。

miR-155抑制物对骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的:观察miR-155抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞增殖和凋亡的影响,探讨miR-155抑制物在骨肉瘤细胞生物学行为中所起的作用。方法:实验分3组,分别为实验组、阴性对照组和正常细胞对照组。实验组转染miR-155抑制物(hsa-miR-155 inhibitors)抑制其细胞内miR-155活性,阴性对照组转染抑制物阴性对照核苷酸序列(microRNA inhibitor N.C),正常细胞对照组不做转染。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验测定3组细胞24小时、48小时、72小时和96小时的吸光度(OD)值,并绘制生长曲线。细胞周期与凋亡的测定采用流式细胞仪检测。结果:两个对照组细胞增殖速度无明显差异,而实验组细胞增殖速度则明显减慢。两对照组细胞凋亡率未见明显差异,而实验组细胞凋亡率(8.5±0.4)%与阴性对照组凋亡率(1.2±0.3)%、空白对照组凋亡率(1.1±0.2)%相比则明显增高(P<0.01)。相比于对照组,实验组G0/G1期细胞所占比例明显增加,与此同时G2/M期与S期细胞比例则显著减少(P<0.01)。结论:miR-155抑制物可通过抑制成骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞内miR-155的活性,显著抑制其增殖能力,促进细胞凋亡和细胞G0/G1期阻滞。miR-155可能会成为骨肉瘤诊治的新靶点。

microRNA-194模拟物对成骨肉瘤细胞系SOSP_9607生物学特性的影响

目的:观察miR-194模拟物对于成骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-194模拟物(hsa-miR-194mimics)转染成骨肉瘤细胞系SOSP_9607,增强SOSP_9607细胞内miR-194的活性。结果:与对照组比较,实验组细胞的增殖能力明显下降。实验组凋亡率(10.1±0.22)%与阴性对照组凋亡率(3.3±0.19)%相比明显增高(P<0.01)。与对照组比较,实验组细胞周期G0/G1细胞比例显著增加,G2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少(P<0.01)。结论:通过转染miR-194模拟物增强SOSP_9607细胞中miR-194的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡造成显著影响。

mirRNA-17-5p抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-17-5p抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,进一步计算抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-17-5p抑制物(hsa-miR-17-5pinhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-17-5p的活性。结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01)。随着浓度从50nmol/L逐渐增加至200nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01)。实验组凋亡率(9.6±1.8)%与阴性对照组凋亡率(3.5±0.4)%相比明显增高(P<0.01)。结论:miR-17-5p抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-17-5p的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用。

miR-15a和miR-16-1模拟物对人骨肉瘤细胞系SOSP-9607凋亡和增殖的影响

目的:探讨miR-15a和miR-16-1模拟物对于人骨肉瘤细胞系SOSP-9607凋亡和增殖的影响。方法:将SOSP-9607细胞分为实验组和对照组。实验组分为miR-15a组、miR-16-1组、miR-15a+miR-16-1组。以miR-15a组为例,采用miR-15a模拟物(hsa-miR-15a mimics)上调SOSP-9607细胞内的miR-15a表达量。对照组分为阴性对照组和空白对照组。采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,并计算细胞增殖效率。结果:通过统计学分析,实验组凋亡率与阴性对照组凋亡率相比明显增高(P<0.05);实验组的细胞增殖率明显低于对照组(P<0.05)。结论:上调SOSP-9607细胞内miR-15a和miR-16-1的表达量可促进SOSP-9607细胞的凋亡并抑制其增殖。

HER2靶向重组截短型Bid片段融合蛋白对骨肉瘤细胞的促凋亡作用

目的:观察人上皮细胞生长因子受体2(HER2)靶向重组的活性截短型Bid(tBid)融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用。方法:将抗HER2单链抗体基因e23sFv、与绿脓杆菌外毒素(PE)的转膜结构域基因(PEII)和tbid基因连接,构建成immuno-tbid(e23sFv-PEII-tbid)基因,将其克隆入真核表达载体pCMV中,转染SOSP-9607细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,通过AnnexinⅤ染色、流式细胞仪检测观察其促凋亡作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测出tB id的表达,SOSP-9607细胞出现明显的固缩,核浓缩等凋亡特征。AnnexinⅤ染色、流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,凋亡率为42%,对照组细胞仅6%,表明细胞膜表面有磷脂酰丝氨酸外翻,提示重组immuno-tbid基因表达后有促凋亡作用。结论:重组immuno-tbid基因可在转染的SOSP-9607细胞中表达,并诱导其细胞凋亡。