VEGF特异siRNA对骨肉瘤细胞凋亡和仿血管发生的影响

目的:探讨VEGF特异siRNA在骨肉瘤细胞株(MG63)增殖、凋亡以及仿血管发生中的作用。方法:以pSilienc-er载体构建VEGF特异siRNA质粒pSilencer-VEGF siRNA,并转染骨肉瘤细胞MG63;将细胞分为pSilencer-VEGF siRNA质粒组(试验组)和空siRNA质粒组(对照组),Western blotting在蛋白水平检测转染重组质粒后MG63细胞VEGF表达情况;MTT比色法、光镜、流式细胞仪结合Annexin V-FITC/PI染色和H-E染色观察质粒转染后骨肉瘤细胞增殖、凋亡和仿血管发生情况。结果:测序证实成功构建了针对VEGF的siRNA重组质粒。转染pSilencer-VEGF siRNA重组质粒后的试验组培养液中及骨肉瘤细胞内VEGF蛋白表达下降;转染后48、72、96h骨肉瘤细胞的增殖抑制率分别为41.67%、43.92%、35.32%,并发生了早期凋亡,凋亡率为28.27%。转染pSilencer-VEGF siRNA重组质粒的骨肉瘤细胞未见仿血管发生,转染空质粒的对照组骨肉瘤细胞则有仿血管发生。结论:RNA干扰VEGF基因能抑制骨肉瘤细胞增殖,促进骨肉瘤细胞早期凋亡,干扰骨肉瘤细胞仿血管发生,为临床基因治疗骨肉瘤提供了新的思路。

反义survivin联合顺铂抑制裸鼠荷骨肉瘤生长(英文)

目的:探讨反义基因治疗与化疗联合应用提高骨肉瘤疗效的可行性及其机制。方法:通过构建荷骨肉瘤裸鼠模型,采用瘤内注射和腹腔给药方式,以survivin反义寡核苷酸(ASODN)配合顺铂(DDP)对瘤鼠进行联合干预治疗,并与各单药组进行比较,观测各组裸鼠肿瘤生长情况、评估瘤体病理形态,免疫组织化学法检测瘤组织survivin蛋白表达,DNA末端原位标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞凋亡水平。结果:与各单药组相比,联合治疗组在显著下调survivin蛋白表达同时,肿瘤细胞凋亡坏死更为明显,肿瘤生长受抑效果更强。结论:ASODN对DDP具有明显增效作用,可弥补DDP耐药缺陷,二者联合可望发挥协同抗瘤效应。

骨旁骨肉瘤的影像学诊断——附16例报告

回顾性分析经手术病理确诊的16例骨旁骨肉瘤的临床表现及影像学特征。16例患者中,男9例,女7例。年龄16～55岁,平均年龄31岁,中位年龄33.5岁。发病部位以股骨下端后方最多见(10/16)。平片显示多数病例为附着于干骺端骨皮质表面的宽基底蘑菇状致密肿块影。4例CT显示于肿块和其下骨皮质间出现狭窄的透亮隙,MRI证实4例骨髓受累及。回顾性分析结果显示,骨旁骨肉瘤具有特征性的影像学表现,CT及MRI能很好地显示骨髓受累程度。本病应与骨化性肌炎和骨软骨瘤等病变相鉴别。

噻莱昔布(celecoxib)对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响

目的:研究环氧化酶2(cyclooxygenase2,COX2)抑制剂celecoxib对人骨肉瘤细胞MG63抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法:MTT比色观察celecoxib的细胞毒性作用及其浓度依赖性;Hoechst33258荧光染色、透射电子显微镜和TUNEL观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及其时间依赖性。结果:celecoxib分别以10、20、40、80μmol/L作用后,细胞生长受到不同程度抑制;荧光显微镜、电镜和TUNEL观察到细胞胞浆浓缩、核凝聚、核碎裂和凋亡小体形成。流式细胞仪显示celecoxib40μmol/L作用24、48、72h后,细胞凋亡率分别与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)。结论:celecoxib能抑制人MG63细胞增殖,诱导细胞凋亡。

Fas抗原和caspase-8调控细菌氧化还原蛋白azurin诱导的人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨Fas抗原和caspase-8在细菌氧化还原蛋白azurin诱导人骨肉瘤细胞凋亡中的调控机制及作用。方法:用150mg/L浓度的azurin处理U2OS细胞,分别作用6、12、24和48h。细胞免疫化学法检测Fas抗原的表达。用荧光试剂盒检测caspase-8的活性。流式细胞仪检测azurin和抗-Fas-抗体诱导的骨肉瘤细胞凋亡百分率,以及加入caspase-8活性抑制剂IETD-FMK后凋亡百分率的变化。结果:Azurin诱导U2OS细胞凋亡后,与对照组比较,Fas抗原表达强度增加(P<0.01),caspase-8活性升高(P<0.01)。Fas抗原表达和caspase-8活性随着azurin作用时间的延长而逐渐升高,至24h后达到高峰,然后缓慢下降,但仍显著高于对照组(P<0.01)。Fas抗原的表达与caspase-8活性变化呈显著正相关(r=0.873,P<0.01)。表达增强的Fas抗原具有转导凋亡信号的功能,抗-Fas抗体借此增强azurin诱导U2OS细胞凋亡的作用。Caspase-8活性抑制剂IETD-FMK能阻断caspase-8活化而抑制azurin或抗-Fas抗体诱导的U2OS细胞凋亡,与抑制剂组比较,细胞凋亡百分率显著差异(P<0.01)。结论:Fas依赖途径可能为细菌氧化还原蛋白azurin诱导U2OS细胞凋亡主要机制之一,caspase-8活性上调可能在凋亡过程中发挥重要作用。

1,25(OH)_2D_3对人骨肉瘤细胞增殖以及Cofilin信号转导通路的影响

目的研究1,25(OH)2D3对人骨肉瘤U2OS细胞系增殖以及Cofilin信号转导通路的影响。方法体外培养人骨肉瘤U2OS细胞,采用CCK-8活细胞计数试剂盒检测经10-7mol/L 1,25(OH)2D3处理后U2OS细胞的增殖变化;用Western Blot法检测Cofilin及P-cofilin表达情况。结果10-7mol/L浓度的1,25(OH)2D3对U2OS细胞株的增殖有明显的抑制作用,并呈时间依赖性。Western blot检测结果显示1,25(OH)2D3对Cofilin的总蛋白表达没有影响,但随着作用时间的延长,P-cofilin的表达水平呈一过性增强(24 h)、然后下降(48-72 h)的趋势。结论1,25(OH)2D3对U2OS细胞的生长增殖有明显的抑制作用,这一作用可能与改变胞内P-cofilin的表达水平有关。

Survivin-shRNA对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用及其机制

目的:研究Survivin-shRNA对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用,并探讨其与凋亡及PI3K/Akt信号通路之间的关系。方法:重组腺病毒Survivin-shRNA转染骨肉瘤MG-63细胞,以1∶5比例进行传代,挑选稳定转染的MG-63细胞并扩增,GFP组和CON组为阴性对照组。采用皮下异种移植法构建裸鼠骨肉瘤模型50只,每3天用卡尺测量肿瘤体积;颈椎脱臼法处死裸鼠,称取骨肉瘤标本的重量;免疫组织化学法检测磷酸化Akt(p-Akt)、生存素(Survivin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)蛋白的表达。结果:骨肉瘤生长曲线显示,与CON组和GFP组相比,Survivin-shRNA组的肿瘤增长缓慢,差异有统计学意义(P <0. 05);肿瘤的重量结果显示,CON组、GFP组及Survivin-shRNA组分别为(2. 13±0. 32) g、(1. 94±0. 27) g及(1. 42±0. 19) g,差异有统计学意义(P <0. 01);免疫组织化学结果显示,p-Akt及Survivin的表达在SurvivinshRNA组中明显低于CON组和GFP组,差异有统计学意义(P <0. 05),而Caspase-3高表达。结论:Survivin-shRNA可抑制裸鼠骨肉瘤的生长,其机制可能是通过调节PI3K/Akt信号通路及Survivin、Caspase-3的表达来实现。

K7M2细胞转染Runx2基因后对MC3T3细胞RANKL基因表达的影响

目的探讨转染Runx2基因后对RANKL及相关细胞因子的影响。方法将鼠骨肉瘤K7M2细胞分成3组,K7M2组,K7M2-neo组和K7M2-Runx2组,应用Westernblot方法检测转染是否成功,选择转染成功的细胞连同K7M2组,K7M2-neo组细胞,应用ELISA方法检测培养上清液中的IL-1α,IL-6,IL-11和PGE2的含量变化,并应用RT-PCR的方法检测应用K7M2组,K7M2-neo组和K7M2-Runx2组以及在K7M2-Runx2组细胞中加入IL-6抗体后的培养液来培养的MC3T3细胞RANKL基因表达的变化,并应用Westernblot方法检测K7M2细胞IL-6R蛋白的表达变化。结果转染Runx2基因后可以有效提高Runx2蛋白的表达,培养的上清液中的IL-6含量明显提高,应用K7M2-Runx2组细胞培液培养MC3T3细胞可以提高其RANKL基因表达,在K7M2-Runx2组细胞培液中加入IL-6抗体后则不会提高MC3T3细胞的RANKL基因表达。结论Runx2基因可以提高MC3T3细胞RANKL基因的表达,这种基因表达的提高是通过IL-6因子来介导的。

骨肉瘤组织中RASSF1A、Cyclin D1蛋白表达及意义

目的探讨Ras相关区域家族1A(RASSF1A)、细胞周期素(Cyclin)D1蛋白在骨肉瘤发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SP法检测RASSF1A、Cyclin D1蛋白在46例骨肉瘤组织(骨肉瘤组)及20例骨软骨瘤组织(对照组)中的表达。结果骨肉瘤组RASSF1A蛋白的阳性率(45.70%)显著低于对照组(95.00%),P<0.01。Cyclin D1蛋白的阳性率(63.00%)明显高于对照组(25.00%),P<0.01。RASSF1A、Cyclin D1表达呈负相关(r=-0.383,P=0.009)。骨肉瘤组低分化组织RASSF1A的阳性率明显高于高分化组织(P=0.009)。结论RASSF1A低表达与Cyclin D1高表达可促进骨肉瘤的发生发展,二者协同作用;二者联合检测能为骨肉瘤的早期临床诊断和治疗提供有利的生物学信息。

7例骨膜骨肉瘤临床预后分析

目的探讨骨膜骨肉瘤的临床病理特征及预后。方法对7例骨膜骨肉瘤患者进行临床表现、病理特征及预后分析。男4例,女3例;年龄14～29岁,中位年龄21岁。4例高级别的骨膜骨肉瘤患者手术后接受化疗。结果 7例患者随访48～128个月,平均84个月,无1例出现局部肿瘤复发和远处转移,均无瘤生存。结论骨膜骨肉瘤是一种罕见的表面骨肉瘤,早期诊断和及时治疗可以改善患者的预后。

瘤段灭活再植治疗膝关节周围骨肉瘤47例临床分析

目的分析在新辅助化疗下,采用瘤段骨切除、灭活、再植治疗骨肉瘤的疗效。方法 1995年1月至2010年1月,对47例膝关节周围骨肉瘤患者施行广泛切除,彻底清除瘤组织,95%乙醇浸泡45min瘤段骨灭活,原位回植,修复关节韧带,髓内钉内固定,手术前、后辅助化疗。结果全部病例平均随访34个月,11例因肺转移死亡,4例感染,2例髓内钉折断,局部复发截肢3例,灭活骨骨折、塌陷3例,并发症发生率48.9%。按Enneking肢体肌肉骨骼肿瘤外科治疗重建术后功能评估标准进行评估。本组术后功能评估为优19例(40.4%),良11例(23.4%),中13例(27.7%),差4例(8.5%),优良率达63.8%。结论瘤段骨切除灭活再植手术治疗原发性骨肉瘤,手术简便,花费低廉,无排斥反应,解除了患者因为肢体的缺失带来的心理障碍,是治疗骨肉瘤保肢的有效方法之一,但术后随访证明瘤段骨灭活再植手术,膝关节功能稍差。

MMP-9和TIMP-1在高危骨肉瘤中的表达及其诊断意义

目的研究高危骨肉瘤中MMP-9和TIMP-1的表达情况,探讨MMP-9/TIMP-1失衡在高危骨肉瘤中的诊断意义。方法对14例高危骨肉瘤、41例恶性程度低的骨肉瘤和I5例正常骨组织行MMP-9和TIMP-1免疫组织化学染色,并对染色情况进行分析。结果高危骨肉瘤组的MMP-9的表达率为100%,呈普遍过表达,明显高于低恶性骨肉瘤组的73.2%的阳性率(P<0.05),而高危骨肉瘤组的TIMP-1的阳性率明显低于低恶性骨肉瘤组(P<0.05)。高危骨肉瘤组的MMP-9/TIMP-1表达失衡率为42.8%,明显高于低恶性骨肉瘤组的12.2%(P<0.05)。结论MMP-9与TIMP-1可作为诊断骨肉瘤的辅助指标。

大剂量甲氨蝶呤多药联合治疗骨肉瘤的疗效分析

目的 探讨大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）多药联合治疗骨肉瘤患者的化疗有效性及对生存期的影响.方法 回顾性总结63例采用多药大剂量联合化疗方案化疗的骨肉瘤患者的临床资料,观察分析多药大剂量联合化疗治疗骨肉瘤的化疗有效率及对3年生存期随访结果.结果 63例患者经多药大剂量联合化疗方案2周期化疗后总有效率为77.8％,其中肿瘤直径与化疗疗效有显著相关性（P＜0.05）.3年总生存率为67.7％,其中完整化疗4周期后对患者3年总生存率及无进展生存期均产生显著影响（P＜0.05）.结论 含HD-MTX多药联合化疗是有效的,完整的化疗是骨肉瘤综合治疗中不可缺少的重要组成部分.

PLK1抑制剂对骨肉瘤细胞增殖的影响及其机制研究

目的探讨Polo样激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)的小分子抑制剂NMS-P937对骨肉瘤细胞增殖的影响及其作用机制,并分析PLK1蛋白水平与临床骨肉瘤患者预后的关系。方法本研究采用HOS、Saos-2骨肉瘤细胞系以及人成骨细胞系HOB-C作为实验细胞,通过Western Blot和荧光定量PCR检测PLK1在不同细胞系中蛋白和m RNA的表达水平;分别用不同浓度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.5μmol/L)的NMS-P937干预骨肉瘤细胞,采用MTT比色法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测不同浓度NMS-P937对骨肉瘤细胞系细胞周期的调控作用;免疫共沉淀技术检测PLK1蛋白与p53蛋白的相互作用情况;通过对骨肉瘤患者的组织芯片分析及随访,分析PLK1蛋白表达水平与临床预后的关系。结果研究结果表明与人成骨细胞系HOB-C细胞相比,HOS、Saos-2骨肉瘤细胞系中PLK1蛋白和m RNA表达水平更高;NMSP937可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖,且经过NMS-P937处理后,S、G2/M期的骨肉瘤细胞Saos-2显著升高,G0/G1期细胞显著降低;细胞免疫共沉淀结果表明PLK1与p53蛋白存在相互作用;生存分析显示PLK1的表达水平与患者生存率呈负相关。结论 PLK1抑制剂可抑制骨肉瘤细胞的增殖,这可能与PLK1通过调节p53蛋白参与细胞周期转换过程有关,此外,PLK1蛋白水平的高度表达与患者不良预后密切相关,提示PLK1蛋白可作为临床潜在治疗骨肉瘤患者的有效靶点。

四肢骨肉瘤新辅助化疗后影像学表现与大体标本的相关性研究

目的探讨四肢髓内型骨肉瘤新辅助化疗后影像学表现与大体标本的相关性。方法选取我科2005年9月-2006年12月四肢髓内型骨肉瘤17例,经全身大剂量三疗程化疗后,常规行术前MRI平扫,术后取沿冠状面剖开的1/2大体标本固定备用,再对留取标本行DR及CT检查,通过分区逐一对比影像学与病理表现。结果 X线、CT与病理检查之间差异显著(P<0.05);术前MRI平扫检查与病理检查之间无显著性差异(P>0.05)。结论 MRI检查骨肉瘤髓内侵润相对误差较小,依据MRI测量结果扩大切除2-3cm是安全的截骨范围。

黑色素瘤优先表达抗原在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义

目的了解黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)在骨肉瘤组织中的表达状况及其表达变化与疾病预后的关系。方法应用免疫组化技术检测95例骨肉瘤患者治疗前肿瘤穿刺活检标本中PRAME蛋白的表达水平,并分析骨肉瘤组织标本中PRAME表达变化与患者临床病理指标及疾病进展、预后关系。结果 95例骨肉瘤患者治疗前穿刺活检组织标本中,PRAME蛋白阴性26例,弱阳性37例,强阳性32例。经分析发现,PRAME蛋白强阳性患者较PRAME蛋白阴性或弱阳性患者预后差(P<0.05),且发生肺转移的风险增加(P<0.05)。结论多数骨肉瘤患者标本组织中出现PRAME基因及蛋白异常表达,而且PRAME基因和蛋白在骨肉瘤组织中表达变化与疾病进展、预后有关。

骨肉瘤化疗后影像学变化与肿瘤细胞PCNA、P-gp表达的相关性研究

目的:分析化疗后骨肉瘤的影像学变化和骨肉瘤细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)及P-糖蛋白(P-gp)表达的相关性,探讨其临床意义。方法:对23例骨肉瘤患者于术前化疗前后行影像学检查,应用免疫组化技术检测化疗前后标本中PCNA、P-gp的表达,计算影像学评分及化疗后肿瘤细胞坏死率(TCNR)。结果:化疗后影像学评分明显比化疗前高,并且影像学评分越高,TCNR越高、预后越好。化疗后PCNA阳性表达率由87.0%降低到47.5%,P-gp阳性表达率由13.0%升高到47.8%,PCNA、P-gp阳性表达率越低预后越好,并且PCNA和P-gp的表达存在相关性。化疗后影像学评分高的患者PCNA、P-gp的阳性表达率低。结论:从细胞分子水平证实了骨肉瘤化疗后的影像学征象是以肿瘤细胞生物学行为为基础的,通过分析化疗后影像学征象和肿瘤中PCNA、P-gp的表达情况,可以预测化疗疗效,指导临床采用正确的治疗方法。

MiR-490-3p靶向HMGA2在骨肉瘤细胞凋亡中的作用

目的以人骨肉瘤MG-63细胞为研究对象,探讨miR-490-3p诱导MG-63细胞凋亡的作用及其分子机制。方法分别设立miR-490-3p mimics组(对照组)、慢病毒lenti-sh miR-490-3p组(药物组),每组设6个复孔。采用MTT法检测miR-490-3p对细胞生长抑制作用;采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测不同实验条件下miR-490-3p对MG-63细胞凋亡率的影响;Western blot检测miR-490-3p对HMGA2、Bcl-2、BAX和Caspase-3蛋白表达的影响。结果 MiR-490-3p能抑制MG-63细胞增殖,药物组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。经3次实验结果,药物组的早期凋亡的细胞比例为58.90%±0.89%,明显高于对照组的5.34%±0.34%,差异有统计学意义(P<0.05)。通过Western blot检测MG-63细胞中HMGA2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin蛋白表达,结果显示miR-490-3p转染后,促进凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,Bax或Bcl-2比率增高,而线粒体凋亡途径下游的Caspase-3蛋白被激活,表达量降低。结论 MiR-490-3p能显著抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,其作用机制可能与靶向HMGA2的表达、上调Bax/Bcl-2蛋白表达比例、激活Caspase-3蛋白级联反应和调控Survivin蛋白表达有关。

骨肉瘤微血管密度与nm23-H1、PCNA表达及预后的关系

目的研究骨肉瘤微血管密度与转移抑制基因nm23-H1表达、增殖细胞核抗原(PCNA)指数相关性及其病人预后的关系。方法应用免疫组化方法检测80例骨肉瘤微血管密度(MVD),以及nm23-H1表达和PCNA指数,并应用Cox模型分析其与预后的关系。结果MVD与nm23-H1表达呈负相关,而与PCNA指数呈正相关。Cox模型多因素分析显示MVD、nm23-H1和PCNA 均为影响骨肉瘤预后的重要因素。MVD低值组比高值组预后好(P<0.05)。在MVD高值组中,nm23-H1高表达组比低表达组预后亦较好(P<0.05)。结论微血管密度可能是骨肉瘤转移的必要条件,而非充分条件,它与nm23-H1和PCNA相互作用,共同影响骨肉瘤的转移和预后。

Survivin和FLIP在骨巨细胞瘤组织中的表达及其临床意义

目的研究Survivin和FLIP(FLICE-inhibitoryproteins即Fas相关死亡域样白介素1-β转化酶抑制蛋白)在骨巨细胞瘤(GCT)中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化技术检测Survivin和FLIP在22例骨巨细胞瘤、13例骨肉瘤和8例正常骨组织中的表达,并分析其与Jaffe病理分级、X线分型、临床分型、综合分期之间的相关性。结果Survivin和FLIP在骨巨细胞瘤中的表达均明显高于正常骨组织(P<0.01),而与骨肉瘤组无显著性差异(P>0.05);骨巨细胞瘤Jaffe病理分级中Survivin和FLIP的表达在Ⅰ级和Ⅱ级之间无显著性差异(P>0.05),但均显著低于Ⅲ级(P<0.05)。在X线分型、临床分型、综合分期之间无显著性差异(P>0.05)。结论Survivin和FLIP在骨巨细胞瘤的发生发展中可能起重要的作用,其检测为判断骨巨细胞瘤的生物学行为、复发、预后,决定治疗方案,开拓新的治疗方法提供了理论依据。