乌骨山羊皮肤黑色素细胞的分布及特征

试验采用免疫组织化学染色对乌骨山羊不同被毛颜色皮肤中的黑色素细胞进行定位,再用多巴组织化学染色法对皮肤中有黑色素分泌的黑色素细胞进行定位,以HE染色法对黑色素细胞的形态进行观察。免疫组织化学染色结果显示,乌骨山羊皮肤中的黑色素细胞主要分布在表皮基底层和毛囊中;多巴组织化学染色结果显示,表皮中没有阳性反应,黑色被毛毛球部及外根鞘均有阳性反应,白色被毛毛球部及外根鞘则没有阳性反应,说明黑色被毛毛球部及外根鞘有成熟的黑色素细胞存在并能合成黑色素。HE染色结果显示,黑色被毛毛囊外毛根鞘中的黑色素细胞和周围细胞区分明显,呈空泡状和活化状态,周围有大量黑色素颗粒分布,白色被毛毛囊外根鞘黑色素细胞呈椭圆状,没有黑色素产生,和周围细胞难以区分。因此,乌骨山羊黑色被毛毛囊外根鞘中黑色素细胞的活化可能参与了乌骨山羊毛色和乌质性状的形成。

人毛囊外根鞘细胞的分离及培养

目的建立毛囊外根鞘细胞的分离和培养方法。方法利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊,采用组织块法和消化法进行细胞培养,倒置显微镜、扫描及透射电镜观察细胞形态,培养各代细胞做生长曲线,RT-PCR检测干细胞相对特异性标识分子K15和细胞分化标识分子外皮蛋白的mRNA表达情况。结果组织块法和消化法均能培养出毛囊外根鞘细胞,并可传代培养,组织块法细胞生长慢,不易汇合,消化法细胞增殖快。各代细胞中K15和外皮蛋白mRNA均有表达。结论消化法适合毛囊外根鞘细胞的体外培养,该方法的建立为进一步分离纯化培养毛囊干细胞奠定了基础。

人头皮毛囊外根鞘无色素黑素细胞的分离和纯化培养进一步研究

目的从人头皮毛囊外根鞘分离纯化培养无色素黑素细胞。方法采用两步酶法0.50%分离酶和0.50%胶原酶Ⅴ获得游离的毛囊,高浓度0.50%胰酶30min消化游离的毛囊外根鞘细胞,并以优化的培养基进行细胞培养。用HMB-45和NKI/beteb单克隆抗体免疫组化染色、透射电镜对培养物进行鉴定。结果培养物中初始贴壁细胞大多数为无色素黑素细胞,仅有少量的角质形成细胞,无成纤维细胞污染。经二次传代差别胰酶处理很容易去除角质形成细胞。取培养3周的细胞经免疫组化和透射电镜鉴定证实为无色素黑素细胞。传3代后细胞得到完全纯化。结论两步酶法结合高浓度的胰蛋白酶处理细胞可彻底清除成纤维细胞,获得无色素黑素细胞的纯培养。

VEGF对体外培养绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的影响

本研究旨在探讨陕北白绒山羊毛囊外根鞘细胞的培养和VEGF对次级毛囊外根鞘细胞增殖、分化及细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、角蛋白10(K10)和成纤维细胞生长因子5(FGF5)mRNA表达量的影响。采集绒山羊体侧部皮肤,并利用消化等方法分离次级毛囊外根鞘细胞,置于37℃、5%CO_2、饱和湿度条件下培养;选用第5代次级毛囊外根鞘细胞,添加不同质量浓度血管内皮生长因子(VEGF),分别处理24、48h,噻唑兰比色法(MTT)检测细胞活力,EdU核酸标记技术检测细胞增殖;实时荧光定量PCR技术检测PCNA、K 10、FGF5mRNA的表达情况。结果显示:1)成功培养出次级毛囊外根鞘细胞,CK17和CK15细胞免疫组化呈阳性。2)VEGF可以促进绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的增殖。相同浓度VEGF处理48h组的细胞活力极显著高于处理24h组(P<0.01);在48h处理组中,100ng·mL^(-1)组的细胞活力极显著高于对照组、1ng·mL^(-1)组、10ng·mL^(-1)组(P<0.01),并显著高于50ng·mL^(-1)组(P<0.05),50ng·mL^(-1)组的细胞活力显著高于对照组(P<0.05);100ng·mL^(-1)组和50ng·mL^(-1)组增殖细胞比例均极显著高于对照组、1ng·mL^(-1)组、10ng·mL^(-1)组(P<0.01),100ng·mL^(-1)组显著高于50ng·mL^(-1)组(P<0.05)。3)PCNA、K10、FGF5mRNA在次级毛囊外根鞘细胞中均有表达。在VEGF处理48h时,PCNA mRNA的表达量100ng·mL^(-1)组最高,极显著高于对照组(P<0.01),显著高于10ng·mL^(-1)组(P<0.05);K10mRNA的表达量对照组最高,极显著高于10ng·mL^(-1)组与100ng·mL^(-1)组(P<0.01);FGF5mRNA的表达量对照组最高,极显著高于100ng·mL^(-1)组(P<0.01)。综上表明,本研究成功分离培养了陕北白绒山羊次级毛囊外根鞘细胞;VEGF能够促进次级毛囊外根鞘细胞的增殖,抑制细胞的分化;VEGF可能通过抑制次级毛囊外根鞘细胞中FGF5基因的表达而促进毛囊生长。

人毛囊细胞来源双层皮肤替代物的构建和组织学特征

目的探索人毛囊细胞构建的双层皮肤替代物的组织学特征。方法用毛乳头细胞、真皮鞘细胞分别与外根鞘细胞构建复合壳多糖双层皮肤替代物,分析其体外和移植至大白鼠后的组织学特征。结果毛囊来源细胞构建的皮肤替代物中表皮细胞排列更紧密、角化突出,真皮内可见与表皮相连的上皮细胞柱及球形膨大细胞团形成。结论毛囊细胞是构建皮肤替代物的良好细胞来源。

甲氧沙林对体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞的激活作用

目的:观察甲氧沙林(8-MOP)对体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞黑素合成相关酶的影响。方法:3种浓度(10、50、100μmol/L)的8-MOP作用于体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞,经免疫荧光染色后,采用激光共聚焦显微镜观察不同浓度、不同作用时间的8-MOP对无色素黑素细胞形态的影响,荧光定量分析酪氨酸酶、酪氨酸相关蛋白(TRP)1、TRP2表达量的变化。结果:50、100μmol/L8-MOP作用于人毛囊外根鞘无色素黑素细胞3d能显著促进酪氨酸酶的表达(P<0.01)熏作用7d后TRP1、TRP2的表达也增加(P<0.05)。结论:8-MOP在体外能直接刺激毛囊外根鞘无色素黑素细胞的活化。

毛囊无黑素性黑素细胞的分离和培养

目的:分离和培养毛囊无黑素性黑素细胞,探讨其生物学特性。方法:采用胶原酶V游离毛囊,0.5％分离酶消化婴幼儿包皮。0.05％,胰酶和0.53 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)消化游离的毛囊和来自包皮的表皮,分别制备单细胞悬液进行培养。传至第3代,待细胞爬上盖玻片后,分别以NKI/beteb和HMB-45单抗染色。结果:毛囊的培养细胞,绝大多数为双极细胞,增殖较快,被NKI/beteb单抗识别,而HMB-45染色阴性。包皮的黑素细胞染色结果则与之相反。结论:毛囊的外根鞘中存在功能和形态上不成熟的无黑素性黑素细胞(AMMC)。AMMC长期培养的成功,有利于研究AMMC在毛囊生物学中所起的作用。

外毛根鞘无色素性黑素细胞的免疫组化研究

目的初步探讨外毛根鞘处于静息状态的无色素性黑素细胞(AMMC)生物学特性。方法取正常人头皮,采用NK I/beteb,HMB-45和TYR(酪氨酸酶),TRP1(酪氨酸酶相关蛋白1),TRP2(酪氨酸酶相关蛋白2)抗体特异染色黑素细胞后,研究AMMC分布、形态和NK I/beteb,HMB-45,TYR,TRP1和TRP2等黑素细胞分化标记分子的表达情况。结果外毛根鞘HMB-45,TYR,TRP1,TRP2四种抗体呈阴性;NK I/beteb阳性染色的细胞位于生长期毛囊外毛根鞘的中段,通常平皮脂腺水平或在其之下,这些NK I/beteb阳性细胞就是AMMC,AMMC数目较少,常成群集中分布,外观胞体偏圆,树突不明显,形态类似于周边的毛皮质细胞。结论AMMC位于外毛根鞘的中下段,形态和功能上均不成熟。

人毛囊外根鞘及毛乳头细胞的迁移和生长观察

目的连续观察成人头皮毛囊外根鞘(ORS)和毛乳头(DP)细胞的生长及形态学变化。方法利用两步酶消化获得正常人头皮毛囊的ORS和DP,采用添加HKGS和HMGS的K-SFM进行体外培养,倒置显微镜下连续观察毛囊ORS和DP的迁移和生长。结果将单个毛囊置于预先涂布血清的培养板2h,然后添加少量培养基,毛囊黏附于培养板的几率增加,数小时后,即可见细胞从ORS及DP处迁移生长,以角质形成细胞(KCs)、成纤维细胞(FBs)为主,黑素细胞(MCs)较少。并且,ORS和DP的迁出和生长有明显不同。如果培养基过多,则多数毛囊悬浮,无细胞迁出,最终死亡。结论预先涂布血清和开始仅添加少量培养基,有利于毛囊黏附,随后细胞迁移生长。

人毛囊外根鞘隆起、真皮鞘和毛乳头细胞高效同步分离培养的方法

目的寻求一种快速高效同步分离培养人头皮毛囊外根鞘隆起（Bulge）细胞、真皮鞘细胞和毛乳头细胞的方法。方法将人头皮标本剪成小块,中性蛋白酶中37℃孵育2h后镜下将带外根鞘的毛干从真皮鞘中拔出,组织块法培养外根鞘隆起（Bulge）细胞;从真皮-皮下组织交界处横断头皮,拔出含毛乳头的真皮鞘,胶原酶D37℃孵育6-8h,多次低速离心,毛乳头沉淀重悬后培养,收集的真皮鞘细胞上清液经高速离心后重悬培养;培养的细胞分别用K19或α-平滑肌动蛋白组化鉴定。结果同一标本可获得纯化的外根鞘Bulge细胞,真皮鞘细胞和毛乳头细胞。结论将现有的分离方法改进和综合运用,可以从同一毛囊标本同步高效获取3种成分细胞。

毛囊混合细胞诱导毛囊重建的研究

目的分离培养人毛囊外根鞘细胞株(ORSC)和人毛囊毛乳头(DPC),在体内和体外诱导毛囊形成。方法利用酶消化法和组织块法获得第三代DPC和ORSC,将上述两种细胞混合后接种于海藻酸钠3D细胞支架,构建毛囊的体外三维模型,同时将该三维模型移植入SD大鼠皮下,8周后移植部位取材,行HE染色、免疫组化和电镜观察毛囊形成情况。结果 SD大鼠移植部位取材,HE染色可见细胞聚集成团状的毛囊样结构,CK14,CK15和波形蛋白染色阳性,电镜下可见支架中有散在细胞分布。结论 SD大鼠体内三维模型培养,证明在该模型中诱导出了具有向毛囊分化倾向的毛囊样结构,为以后成功重建毛囊做出了有益探索。

308 nm激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞黏附、移行及酪氨酸酶相关蛋白表达的影响

目的:研究308 nm准分子激光(EL)联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黏附、移行及酪氨酸酶相关蛋白(TRP-1及TRP-2)表达的影响,初步探讨其对AMMC黑素合成影响的作用机制。方法:体外培养的AMMC分别予308nm EL(激光组)、胡椒碱(胡椒碱组)及二者联合(联合干预组)作用72 h、120 h及168 h,同时设阳性对照组及空白对照组。激光共聚焦显微镜观察AMMC黏附及移行情况,并定量分析荧光染色后AMMC细胞内TRP-1及TRP-2表达。结果:与空白对照组比较,其余4组均能不同程度地促进AMMC的黏附及移行。联合干预组、激光组及阳性对照组TRP-1及TRP-2表达均上调,其中联合干预组促进作用最强。胡椒碱作用72 h可促进AMMC细胞内TRP-1表达,且呈浓度依赖性;而对TRP-2的表达无影响。结论:308 nm EL联合胡椒碱具有促进AMMC黏附、移行及提高细胞内TRP-1及TRP-2表达的作用。

尿激酶型纤溶酶原激活物在毛囊中的表达

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物 (urokinase typeplasminogenactivator,uPA)在毛囊发育过程中的原位表达及在体外培养的毛囊细胞中的表达。方法 用免疫细胞化学 (immunocytochemistry ,ICC)和原位杂交 (insituhybridization ,ISH)技术研究了人及小鼠在毛囊生长周期的不同时期uPA的表达 ;体外培养小鼠毛囊外根鞘 (outerrootsheath ,ORS)细胞并用ICC方法研究了ORS细胞uPA的表达。结果 在毛囊生长期的早期 (即毛囊形成期 ) ,毛囊角质形成细胞 (keratinocyte,Kc)表达uPA ,而其它时期均不表达 ;体外培养的ORS有uPA表达。结论 uPA与Kc的快速增殖和迁移相关 ,在毛囊的发育中起重要作用。

尿激酶型纤溶酶原激活物对毛囊外根鞘细胞增殖的影响

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物 (Urokinase typeplasminogenactivator,uPA)对体外培养的毛囊外根鞘 (Outerrootsheath ,ORS)细胞增殖的作用。方法 体外培养了小鼠ORS细胞 ;用MTT法研究了uPA促进因子肝细胞生长因子 (Hepatocytegrowthfactor ,HGF)和uPA抑制因子Amiloride处理后ORS细胞的增殖变化 ;用RT PCR方法研究了ORS细胞的uPAmRNA的表达情况 ,以及HGF和Amiloride处理ORS细胞后uPA的mRNA表达的变化。结果 体外培养的ORS细胞有uPA表达 ;HGF可促进uPAmRNA的表达并促进ORS细胞的增殖 ;Amiloride抑制uPAmRNA表达并抑制ORS细胞增殖。结论 毛囊ORS细胞表达uPA ,HGF促进uPA的表达并促进ORS细胞增殖 ,Amiloride通过抑制uPA的表达和其活性抑制ORS细胞的增殖。

在双层皮肤替代物中诱导毛囊形成的初步研究

目的探索人毛乳头细胞和外根鞘细胞在双层皮肤替代物中诱导毛囊形成的可能性。方法用毛乳头细胞和与外根鞘细胞构建复方壳多糖双层皮肤替代物,观察其体外和大白鼠移植后的组织学特征。结果体外毛乳头细胞和外根鞘细胞构建的皮肤替代物表皮细胞排列更紧密、角化突出,真皮内可见与表皮相连的上皮细胞柱及球形膨大细胞团。但移植后未见肯定的毛囊样结构形成。结论目前的细胞培养技术尚不能在双层皮肤替代物中诱导毛囊形成。

毛囊外根鞘NKI/beteb和HMB-45免疫组化及胰酶消化后细胞的电镜观察

目的:研究头皮毛囊外根鞘中无活性黑素细胞的存在部位以及毛囊经胰酶消化的细胞组成。方法:拔取正常头发,琼脂预先包埋后,切片行NKI/beteb和HMB-45单抗染色。另取毛囊用胰酶消化,收集细胞,在透射镜下进行观察。结果:拔取的正常毛囊外根鞘中存在NKI/beteb阳性细胞,而HMB-45染色阴性。在毛母质中有大量的HMB-45阳性细胞。毛囊经胰酶消化的细胞为有活性的黑素细胞(MC)、无色素性黑素细胞(AMMC)、毛皮质细胞和成纤维细胞。结论:毛囊外根鞘中存在功能和形态不成熟的AMMC。

皮肤组织工程中毛囊外根鞘细胞增殖能力及细胞角蛋白表达的意义

目的:通过培养人毛囊外根鞘细胞群,观察其增殖活性及细胞角蛋白K19的表达。方法:利用人头皮拔出的毛发,以组织块法和酶消化法培养毛囊外根鞘细胞,用四氮噻唑蓝(MTT)法比较其与表皮角质形成细胞的增殖能力,用免疫组化检测培养外根鞘细胞中细胞角蛋白K19的表达。结果:外根鞘细胞具有较表皮角质形成细胞更强的增殖能力,而且在培养的外根鞘细胞中有大量细胞角蛋白K19阳性的细胞。结论:由于外根鞘细胞具有较表皮角质形成细胞更强的增殖能力,同时含有大量K19阳性细胞,可以作为皮肤组织工程种子细胞来源。

胸腺素β4影响毛囊生长的研究

目的:通过观察在不同浓度胸腺素β4干预下,毛囊外毛根鞘细胞的增殖以及毛发的生长情况,推测胸腺素β4促毛囊生长发育的作用机制。方法:取乳鼠触须部皮肤,分离毛囊及毛囊外毛根鞘细胞,加入不同浓度胸腺素β4,与空白组作对照,并用cell counting kit(CCK)-8细胞增殖曲线描述毛囊外毛根鞘细胞的增殖情况。结果:胸腺素β4干预组毛囊外毛根鞘细胞的增殖以及毛发的生长情况与对照组具有统计学差异,且浓度为0.015%胸腺素β4促进作用最明显。结论:胸腺素β4可通过促进毛囊外毛根鞘细胞的增殖来促进毛发生长。

雄激素与体外培养的人毛乳头细胞和外根鞘细胞相互作用的研究

目的观察不同浓度雄激素(睾酮)对体外培养人毛乳头细胞和外根鞘细胞增殖活性的影响。方法采用脱发和非脱发成人头皮标本,用胶原酶消化法分离毛乳头,在角质形成细胞无血清培养基上,对其进行体外培养。采用非脱发成人头皮标本,组织法培养毛囊外根鞘细胞。然后将不同浓度睾酮加入两种毛乳头细胞与外根鞘细胞的共同培养基中,比较其对外根鞘细胞的增殖活性的影响。结果不同浓度睾酮对单独培养的两种毛乳头细胞和外根鞘细胞的增殖性均无作用(与对照组相比P>0.05)。10-9ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-8ml/L浓度、10-7ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与非脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,可促进外根鞘细胞增殖。而10-10ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-9ml/L浓度、10-8ml/L浓度、10-7ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,对外根鞘细胞出现增殖抑制作用。结论睾酮对外根鞘细胞的影响,与其剂量和毛乳头细胞的存在有关。在这个过程中,毛乳头细胞可能起介导作用。

天疱疮患者头发毛囊直接免疫荧光检测及其临床意义探讨

目的评价天疱疮患者头发毛囊直接免疫荧光检测的临床意义。方法每例患者头发约20根,采取直接染色方法进行直接免疫荧光检查。结果天疱疮患者毛囊直接免疫荧光示FITC标记的羊抗人IgG抗体在毛囊表皮下的外毛根鞘呈网状沉积,其荧光强度与天疱疮患者病情严重程度呈正相关(r=0.505,P<0.05)。随访也发现,病情波动,毛囊DIF强度也随之变化,二者呈正相关。结论天疱疮患者毛囊直接免疫荧光强度在一定程度上反映与病情严重程度的相关性,推断对其强度的监测可用于评价疾病的严重程度并指导临床治疗。