产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其蛋白结构预测

参考GenBank中已公布的产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OxB)的参考序列(M77128)设计了一对扩增OXC酶蛋白基因的引物,对产甲酸草酸杆菌(ATCC 35274)的DNA抽提物进行扩增,获得了特异性的扩增片段.运用Lnternet网络上的数据库及程序,对OXC酶蛋白的理化性质、结构和功能进行生物信息学分析.结果显示克隆序列与参考序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列的同源性达到99.9%和99.6%,预测该酶蛋白是分泌到胞外行使生物学功能的胞外酶,具有良好的抗原性和亲水性,二级结构是以α-螺旋为主的混合型蛋白而且其二级结构预测显示OXC酶蛋白属于硫胺素焦磷酸依赖酶家族,和其它酶家族成员一样能够发挥降解草酸的功能.

可分解草酸小鼠肠干细胞群的构建

目的通过提取草酸分解菌的分解草酸功能基因frc和oxc，转染小鼠肠干细胞群使之获得草酸分解功能。方法（1）构建能同时表达oxc和frc基因的双表达载体质粒pIRES—oxc—frc。（2）分离培养小鼠肠干细胞群，并了解其生长分化功能。（3）将pIRES-oxc-ffc通过脂质体转染至小鼠肠干细胞群中，经过G418筛选后，了解验证转基因肠干细胞群生长、分化及基因表达状况。（4）用离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度，鉴定其草酸分解功能。结果oxc和frc基因片段与GenBank提供的序列比较有极高的同源性。带有oxc和frc基因片段的重组质粒能顺利转染小鼠肠干细胞群，并能在后者中表达。转基因小鼠肠干细胞群培养液中草酸浓度[（2．48±0．03）g／L]低于普通小鼠肠干细胞群和空白对照组[（2．69±0．01）、（2．69±0．01）g／L，P〈0．01]。结论产甲酸草酸杆菌分解草酸的重要功能基因oxc和frc基因能在体外转入小鼠肠干细胞群，并使后者具有草酸分解功能；原核细胞的多个基因能在一定条件下通过基因工程技术转入真核细胞。

体外诱导可分解草酸成人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的研究

目的体外培养并转染了产甲酸草酸杆菌（Ox-F）草酸分解基因h℃和oxe的成人骨髓间充质干细胞（hMSCs—fre—oxe），并诱导其向肝细胞分化。方法体外培养转染了草酸分解基因的P4代hMSCs，并通过含40μg/L肝细胞生长因子（HGF）＋10μg／L胰岛素样生长因子（FGF）-4所组成的培养液诱导其向肝细胞分化。在分化过程中通过显微镜观察分化细胞形态变化。以实时定量聚合酶链反应（Real—timePCR）、Westernblot技术和免疫细胞化学技术检测细胞内肝细胞特异标志物甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白-18（CK-18）和目的基因frc、OXC及其产物融合蛋白mye—FCOAT、flag—OCOAD的表达。成熟肝细胞L-02和转染了空病毒载体的hMSCs（hMSCs．vector）分别作为阳性对照组和阴性对照组。结果可分解草酸的hMSCs—frc—OXC在体外可成功培养，细胞经上述培养液诱导后，细胞形态逐渐变短，变成多角形。Real—timePCR可检测在诱导组细胞中AFP、ALB、CK—18和草酸分解基因frc、OXe表达，而未经诱导细胞组AFP、ALB、CK-18则未表达，未转染目的基因的细胞组fre、oxe未见表达。免疫细胞化学检测诱导28d后细胞可表达ALB，未经诱导细胞组ALB表达呈阴性。Westernblot技术检测诱导第14、28天细胞中AFP、CK-18表达较未诱导组明显增加（P〈0．05），与成熟肝细胞相似，并表达myc-FCOAT、flag—OCOAD，而未转染目的基因细胞组表达呈阴性。结论含有草酸分解基因的hMSCs—frc—OXC体外通过一定条件诱导可以向肝细胞方向分化，经诱导分化后细胞仍可成功表达frc和oxe基因及其产物。