益气活络法对糖尿病肾病大鼠肾脏组织中TNF-α、p-PKC表达影响的实验研究

目的:观察芪明颗粒对糖尿病肾病大鼠p-PKC、TNF-α表达的影响,以揭示芪明颗粒治疗糖尿病肾病的部分作用机理。方法:SD大鼠随机分为空白对照组(A组),模型对照组(B组),贝那普利西药对照组(C1组),黄葵中药对照组(C2组),芪明颗粒治疗组(D组),每组10只。于实验第8周末检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),24 h尿微量白蛋白;采用光镜观察肾皮质形态学改变;采用ELISA法检测肾组织中TNF-α、p-PKC的水平。结果:(1)C1、C2、D组FBG、Scr、BUN、UAER均高于A组(P<0.01),但明显低于B组(P<0.01或P<0.05)。(2)C1、C2、D组TNF-α、p-PKC水平较B组明显改善(P<0.01)。(3)光镜下,C1、C2、D组肾脏病理改变较B组明显改善。结论:芪明颗粒能通过减少糖尿病肾病大鼠TNF-α、p-PKC水平减少尿白蛋白,改善肾功能和肾组织结构,对糖尿病大鼠肾脏有保护作用。

P-gp、PKC-α和MRP在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义

目的探讨P-gp、PKC-α和MRP在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义。方法运用免疫组织化学技术(S-P法)检测P-gp、PKC-α和MRP在50例上皮性卵巢癌、20例卵巢良性肿瘤和10例正常卵巢组织中的表达。结果P-gp、PKC-α和MRP三个指标在上皮性卵巢癌组织中阳性率分别为48.0%、56.0%、60.0%,显著高于正常卵巢和良性肿瘤(P<0.05);P-gp和PKC-α表达存在密切的相关关系(P<0.01);卵巢癌P-gp、PKC-α和MRP表达阳性者的化疗反应率分别为25.0%、25.0%、33.3%,低于阴性表达组(P<0.05);复发患者P-gp和PKC-α阳性表达率明显高于未复发的患者(P<0.05),MRP表达与复发无关(P>0.05)。单因素分析表明,P-gp、PKC-α和MRP与卵巢癌患者的生存期和不良预后有关。多因素分析表明,P-gp及三个指标共同表达与患者的生存率有关。结论卵巢恶性肿瘤中P-gp、PKC-α和MRP阳性表达与临床化疗耐药有关,并影响患者的生存率。联合检测三个指标对临床化疗疗效判断和患者预后估计具有积极的指导作用。

卵巢癌中PKC和P-gp的表达及其临床意义

目的 探讨卵巢癌组织蛋白激酶C(PKC)和 P 糖蛋白(P gp)表达及其临床意义。方法 用免疫组化S P法检测35例卵巢癌、20例卵巢良性肿瘤和20例正常卵巢组织中PKC和P gp的表达,并进行相关临床因素分析。结果 (1) PKC、P gp在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于在良性及正常组织中的表达;初治和复发病例PKC阳性表达有显著差异(P<0.05)。(2) 卵巢癌 PKC的表达与临床病理因素无直接关系。(3) 卵巢癌中PKC和P gp的表达有显著相关性(P<0.05)。(4) 化疗对 PKC表达阳性和阴性卵巢癌患者的有效率分别为23.5%、66.7%(P<0.05)。(5) PKC表达阴性患者的预后优于阳性者(P=0.039)。结论 PKC表达与P gp的表达明显相关, 可能在卵巢癌多药耐药中起重要作用。

shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

目的观察shDNA-PKcs沉默DNA-PKcs基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU耐药性的影响。方法采用双酶切、测序分析鉴定shDNA-PKcs干扰质粒;用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs质粒转染BEL7402/5-FU细胞,根据荧光细胞数计算转染率,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测细胞药物敏感性;Real-time PCR和Western blot检测P-gp mRNA和蛋白表达。结果双酶切鉴定结果显示质粒约为6300bp,测序结果显示插入序列为shDNA-PKcs序列。荧光细胞计数显示质粒的转染率为62.2%。Real time PCR及Western blot检测结果显示DNA-PKcs mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%、71.8%;MTT检测结果显示shDNA-PKcs实验组的ADM和5-FU的IC50值比对照组ADM、5-FU低(P<0.05),DDP和MMC的IC50值与对照组比无统计学意义(P>0.05)。Real time PCR和Western blot检测结果显示实验组P-gp mRNA、蛋白表达水平均比对照组低(P<0.01)。结论 shDNA-PKcs干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中DNA-PKcs表达,增加细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与P-gp蛋白的下调有关。

SNI大鼠神经痛维持期脊髓背角TRPV1的活化形式及低频电针干预作用

[目的]探讨神经痛维持期脊髓背角辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid type1,TRPV1)的活化形式及低频电针的干预作用。[方法]将SD大鼠随机分为正常组(normal组)、假手术组(sham SNI组)、模型组(SNI组)和电针组(2Hz EA组),每组8只。建立大鼠坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury,SNI)模型,取术侧足三里、昆仑穴进行2Hz电针干预,每日1次,连续14天,检测大鼠术侧后足缩腿阈(paw withdrawal threshold,PWT),观察大鼠痛觉超敏反应。运用免疫印迹法检测术侧脊髓背角TRPV1、p-TRPV1及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)水平,用免疫荧光法检测术侧脊髓背角TRPV1及PKC阳性细胞表达情况。[结果]SNI模型大鼠维持期出现痛觉过敏,PWT下降(P<0.01),术侧脊髓背角TRPV1水平、PKC水平均升高(P<0.01),p-TRPV1水平无显著变化(P>0.05),sham SNI组大鼠PWT无明显变化。低频电针提高SNI模型大鼠的PWT(P<0.01),降低脊髓背角TRPV1与PKC水平(P<0.01)。[结论]神经痛维持期脊髓背角TRPV1活化以表达上调为主。低频电针能改善维持期神经痛,其机制可能与其有效下调PKC介导的TRPV1信号通路有关。

ONO-AE-248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡的生化信号转导初探

目的:研究ONO-AE-248诱发中性粒细胞(PMN)非凋亡性程序化细胞死亡过程中,细胞死亡相关的蛋白分子caspase-3、caspase-8、p-38MAPK和PKC的作用,探讨这种细胞死亡的分子机制。方法:运用光镜和DNA电泳对PMN形态学变化和生化特征进行观察和评估;通过Western blot显示PMN中caspase-3、caspase-8活性改变和p-38MAPK磷酸化改变;运用MTS法检测PKC抑制剂对PMN活性的影响。结果:PMN经ONO-AE-248刺激,绝大多数分叶核融合成单叶核(12小时),DNA琼脂糖电泳结果显示缺乏梯状条带(24小时),而且ONO-AE-248对caspase-3、caspase-8活性和p-38MAPK磷酸化水平无明显影响。然而,PKC抑制剂STS和H-7能显著抑制ONO-AE-248对PMN的促死亡效应。结论:ONO-AE-248所诱导的PMN死亡可能是一种非凋亡性的主动性细胞死亡,即非凋亡性程序化细胞死亡。该死亡过程不依赖caspase-3、caspase-8的活化和p-38MAPK的磷酸化,但是PKC可能发挥正向的调控作用。

蛋白激酶C对Pgp介导的K562细胞耐药性的影响

目的 研究蛋白激酶C(PKC)在P 糖蛋白 (Pgp)介导的人类白血病K5 6 2细胞多药耐药中的作用。方法 用苔盼蓝拒染法检测药物敏感性 ,用免疫组织化学法检测Pgp的表达 ,用流式细胞仪检测细胞内柔红霉素 (DNR)积聚 ,用Takai法及Westernblot法分别检测PKC活性和PKCα含量。结果 耐药株K5 6 2 /D细胞对DNA及多种抗癌药物显示多药耐药性 ,并存在Pgp过度表达。K5 6 2 /D与敏感株K5 6 2 /S细胞相比 ,PKC总活性无明显差别 ,但PKCα含量显著增高。PKC激活剂TPA增加K5 6 2 /S和K5 6 2 /D细胞的PKC活性 ,使PKC和PKCα由胞质向胞膜转位 ,K5 6 2 /D细胞内DNA积聚减少。PKC抑制剂staurosporine减少K5 6 2 /S和K5 6 2 /D细胞的PKC活性及PKCα含量 ,增加K5 6 2 /D细胞内DNA积聚。结论 PKCα在K5 6 2 /D细胞中显著增高 ,上调PKC ,使K5 6 2 /D细胞内DNA积聚减少 ,下调PKC ,使K5 6 2 /D细胞内的DNA积聚增加 。

鼻咽癌KDR受体信号传导相关蛋白的表达及意义

目的分析鼻咽癌组织中KDR及其下游信号分子PKC-β和p-ERK的表达,并探讨上述蛋白表达与鼻咽癌患者临床特征和生存期的关系。方法免疫组织化学法检测110例鼻咽癌和30例鼻咽良性病变石蜡切片中KDR、PKC-β和p-ERK的表达情况,用Spearman法分析它们之间的相关性,Kaplan-Meier法计算生存情况,行Log-rank检验和Cox比例风险模型分析。结果鼻咽癌组织中KDR、PKC-β和p-ERK阳性表达率分别为88.2%(97/110)、63.6%(70/110)和51.8%(57/110),而在鼻咽良性病变阳性表达率低。鼻咽癌组织中KDR表达与PKC-β及p-ERK表达呈正相关(r=0.297,P=0.002;r=0.336,P<0.001),PKC-β表达与p-ERK表达呈正相关(r=0.301,P=0.001)。KDR和p-ERK表达与原发肿瘤的侵犯范围相关(P<0.05);PKC-β和p-ERK表达与临床分期相关(P<0.05);KDR和PKC-β表达与肿瘤局部复发或远处转移相关(P<0.05)。3种蛋白表达均与总生存不佳相关(P<0.05)。Cox多因素相关分析显示年龄>50岁为不良预后因素(P<0.05)。结论 KDR及其下游信号分子PKC-β和p-ERK在鼻咽癌中表达,与鼻咽癌患者的临床特征和预后关系密切。

卵巢癌中蛋白激酶C的表达及其临床意义

目的 探讨上皮性卵巢癌组织蛋白激酶C (proteinkinaseC ,PKC)的表达和化疗耐药的关系 ,以及与P -糖蛋白 (P -gp)的相关性。方法 用免疫组化S -P法检测 35例卵巢上皮性肿瘤组织、 2 0例卵巢良性肿瘤组织和 2 0例正常卵巢组织中PKC和P -gp的表达 ,并进行相关临床因素分析。结果 ①PKC、P -gp在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于在良性及正常组织中的表达 ;并且PKC和P -gp的表达有相关性 (P <0 0 5 ) ;②卵巢癌PKC的表达与临床病理因素无直接关系 ;③恶性肿瘤中 ,初治和复发的PKC表达阳性率分别为 34 8%和 75 % ;④化疗对PKC表达阳性和阴性卵巢癌患者的有效率分别为 2 3 5 %、 6 6 7% (P <0 0 5 ) ;⑤PKC表达阴性患者的预后优于阳性者 (P =0 0 39)。结论 PKC表达与卵巢癌组织化疗耐药明显相关 ,可能在P -gp介导的卵巢癌多药耐药中起重要作用。

探讨干预小鼠急性酒精性肝损伤细胞凋亡的时间窗

目的 建立小鼠急性酒精性肝损伤的模型,通过测定肝脏组织内的相关增殖凋亡蛋白的变化,探讨抑制其细胞凋亡的治疗时间窗,以指导临床治疗肝损伤.方法 将30只雄性KM种小鼠饲养于首都医科大学清洁级动物房,随机分为两组（随机数字法）.对照组10只给予正常喂养,实验组20只,一次性给予50％乙醇（12 mL/kg）灌胃,分别在灌胃6h （m6h）和12 h（m12 h）两个时间点处死小鼠各10只.苏木素-伊红（HE）染色法观察小鼠肝脏组织病理学的变化.应用Western-blot的方法监测小鼠肝脏中蛋白T-ERK,P-ERK,PKC,P-PKC,caspase-3的含量变化.用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理,进行方差分析,以P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 通过观察小鼠灌酒后的行为变化,结合形态学指标验证小鼠急性酒精性肝损伤的模型复制成功,小鼠无死亡,实验组小鼠出现嗜睡、行动迟缓等醉酒状态.实验组经酒精灌胃6h所测指标较对照组没有统计学意义,而经酒精灌胃12 h,肝小叶结构紊乱,肝细胞内脂肪空泡形成,与对照组比较,P-ERK和P-PKC显著降低[（2.41＆#177;0.38）, （0.97＆#177;0.25）,F=4.82,P＜0.05;（0.16＆#177;0.00）,（0.08＆#177;0.01）,F=29.63,P＜0.05],caspase-3显著升高[（0.30＆#177;0.02）,（0.11＆#177;0.01）,F=34.38,P＜0.05].结论 给予小鼠大剂量酒精灌胃后,凋亡主要集中在12 h出现,因此抑制小鼠急性酒精性肝损伤细胞凋亡的时间窗可能存在于6～12h之间.

不同频率电针百会、水沟穴对大鼠血脑屏障开放效应及调控机制

目的:观察不同频率电针对脑缺血再灌注恢复期大鼠血脑屏障(BBB)开放效应,探讨电针促血脑屏障开放调控机制。方法:频率研究:150只健康雄性SD大鼠建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,饲养3周后,按随机原则分为模型组、假手术组及2、15、30、50、100Hz组。检测大鼠脑含水量以及伊文思蓝(EB)透过量。机制研究:180只SD大鼠建立MCAO模型,饲养3周后,随机分为模型组、假手术组、电针组、假电针组、电针+PKC抑制剂组;检测大鼠大脑皮层蛋白激酶C亚型β1(PKCβ1)的磷酸化水平、P-糖蛋白(P-gp)以及mdr1a、mdr1b m RNA的表达。结果:2Hz组、100Hz组大鼠脑组织EB含量明显升高(P<0.05);模型组与其余4组比较,大鼠脑组织含水量差异无统计学意义。与模型组比较,2Hz组大鼠大脑皮层的PKCβ1、p-PKCβ1/PKCβ1均显著提高(P<0.05),电针组P-gp的IHS评分显著降低(P<0.05),电针组mdr1、mdr1b m RNA的表达均明显降低(P<0.05);电针+PKC抑制剂组mdr1a m RNA表达高于电针组(P<0.05)。结论:2Hz、100Hz电针刺激对脑缺血再灌注恢复期大鼠BBB均具有一定开放效应,且无明显脑水肿出现;电针诱导大鼠BBB开放可能是通过促使PKCβ1磷酸化,下调药物外排系统P-gp、mdr1a m RNA,抑制P-gp在大脑皮层毛细血管内皮细胞的表达实现。

电针对糖尿病周围神经痛大鼠脊髓背角缓激肽B1受体和磷酸化蛋白激酶C的影响

目的:观察电针对糖尿病周围神经痛(DPNP)大鼠空腹血糖、热痛阈、脊髓背角缓激肽B1受体(B1R)和磷酸化蛋白激酶C(p-PKC)的影响。方法:高脂高糖饲养联合腹腔注射STZ构建DPNP大鼠模型,选取足三里穴、昆仑穴予以电针干预,每日1次,每次30min,持续7d。检测各组大鼠空腹血糖和热痛阈,Western Blot检测大鼠腰段脊髓背角B1R和p-PKC的蛋白表达水平。结果:第49天后,与正常组比较,模型组空腹血糖显著升高(P<0.01),热痛阈显著降低(P<0.01);电针干预后,与模型组比较,电针组热痛阈显著提高(P<0.01),B1R和p-PKC的蛋白表达显著下降(P<0.01)。结论:电针能显著下调DPNP大鼠脊髓背角B1R和p-PKC的蛋白表达,该作用可能参与电针缓解DPNP的过程。