紫苏羟苯基丙酮酸还原酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆紫苏迷迭香酸生物合成途径中的羟苯基丙酮酸还原酶基因(Hydroxy phenylpyruvate reductase gene,HPPR),通过已报道的其他物种的HPPR基因序列设计特异性引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了紫苏HPPR基因片段,并命名为PfHPPR(GenBank登录号:HM152567.1),该片段长为426bp,共编码142个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,PfHPPR基因编码的氨基酸序列与彩叶草、鼠尾草和丹参的一致性分别为92%、93%和92%。采用半定量RT-PCR法分析该基因在紫苏叶中的表达最高,茎次之,根中相对较弱。内源性植物激素信号分子及外界刺激对PfHPPR表达量影响的实验表明PfHPPR的表达受脱落酸、水杨酸和UV-B信号调控途经的影响。

预苯酸脱氢酶和对羟基苯丙酮酸还原酶与野葛异黄酮的生物合成

以野葛悬浮细胞系为研究体系,测定PPDH酶和HPPR酶活性,并对细胞生长周期中2种酶活性与野葛异黄酮生物合成的相关性进行分析。结果表明,在野葛培养细胞中检测到PPDH酶的活性,并能催化预苯酸生成对羟基苯丙酮酸,由野葛培养细胞中提取的HPPR粗酶液能催化对羟基苯丙酮酸形成对羟基苯丙乳酸,从而在野葛细胞培养体系中证实了从预苯酸经对羟基苯丙酮酸到对羟基苯丙乳酸的反应。在野葛细胞培养周期中,随着PPDH酶和HPPR酶活性的提高,细胞培养体系中异黄酮的积累逐步增加,但异黄酮的积累滞后于酶活的提高;PP-DH酶和HPPR酶活性与野葛异黄酮生物合成间存在较高的相关性,相关系数分别为0.881 2和0.804 6。试验结果为以预苯酸为前体化合物,经对羟基苯丙酮酸和对羟基苯丙乳酸到香豆酸的中间代谢过程的一条异黄酮生物合成新途径的证实提供了初步的酶学研究证据。

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析。以‘太原806’、‘小白麦’、‘京冬8’及‘京411’为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据。序列分析表明:TaHPPR基因含有1个975 bp的完整开放阅读框,编码324个氨基酸;Ta HPPR蛋白含有一个NAD-binding domain结构域。系统进化分析表明:TaHPPR基因与二粒小麦处于同一分支,其亲缘关系最近。荧光定量表达分析表明:TaHPPR基因在小麦根、小穗(除去雄蕊)、叶鞘均有表达,其中,根中表达量最高;在低温、干旱、高盐和ABA胁迫处理下Ta HPPR基因表达均有所下降;在高抗盐品种‘京冬8’中,TaHPPR基因表达升高,而在敏感品种‘小白麦’和较敏感品种‘京411’中,TaHPPR基因表达受到抑制。亚细胞定位结果显示,TaHPPR蛋白主要在线粒体中表达,过表达TaHPPR基因可能增加小麦的抗盐性。本研究分析了TaHPPR在小麦逆境应答及不同品种中盐胁迫处理下的表达特性,为研究小麦抗逆育种分子机制提供新基因资源和新的思路。

丹参SmHPPR1基因调控丹酚酸生物合成的研究

丹参是临床上治疗心脑血管疾病的常用中药,其主要水溶性活性成分为迷迭香酸和丹酚酸B,由苯丙烷类代谢途径产生。4-羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)是苯丙烷代谢途径中的关键酶。本课题组前期在丹参中克隆了SmHPPR1基因并构建了植物表达载体。在此基础上,获得了携带SmHPPR1的转基因拟南芥阳性植株并测定4-羟基苯乳酸的含量;诱导了过表达SmHPPR1丹参毛状根并进行有效成分含量测定和转录组分析。结果显示:携带SmHPPR1的T1代转基因拟南芥中4-羟基苯乳酸含量为0.594 mg·g^(-1);SmHPPR1-OE-3毛状根中的迷迭香酸、丹酚酸B、总丹酚酸含量分别是control-3毛状根的1.09、1.29、1.15倍,丹参素是control-3毛状根的36.26%;转录组分析显示,SmHPPR1过表达引起了SmTAT2表达量上调;蛋白-蛋白相互作用表明CYT(TR74706_c0_g1)、NADP^(+)(TR26565_c0_g1)和NADP^(+)(TR68771_c0_g1)是网络的中心节点并参与代谢过程、细胞过程等。以上研究表明,SmHPPR1在携带SmHPPR1的转基因拟南芥中能催化4-羟基苯丙酮酸还原为4-羟基苯乳酸;丹参毛状根中过表达SmHPPR1可以通过协同调控其他途径基因来提高丹酚酸的含量。

丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因RNAi表达载体的构建

为研究丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因(SmHPPR)在丹酚酸类化合物生物合成中的作用,构建SmHPPR的RNAi植物表达载体。根据SmHPPR的序列,设计4对含有酶切位点的特异性引物,以丹参无菌苗叶片cDNA为模板,分别扩增两段目的基因的正反向片段(约402 bp和346 bp),经T-载体克隆并测序后,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置(正向目的片段插人中间载体pKANNIBAL内含子左侧,反向目的片段插入该载体内含子右侧),构建了含有发夹结构的RNAi植物表达载体pART27-HPPR1sa、pART27-HPPR2sa和阴性对照载体pART27-Intron。利用三亲杂交法,将这3个载体导入到发根农杆菌LBA9402中。酶切鉴定和PCR扩增结果表明RNAi表达载体构建成功并成功导入到发根农杆菌LBA9402中,为下一步研究SmHPPR基因的功能奠定基础。