Method for Detecting NADPH-Cytochrome P450 Reductase in Liver Microsomal Fractions by Using Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and NADPH-Diaphorase Staining

By combining native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-diaphorase staining, a simple method for detecting NADPH-cytochrome P450 reductase in tissue samples was established. When rat liver microsomal fractions were examined by this method, several bands with different mobility were visualized. Western blot analysis indicated that the band which appeared in the most anodal position among them represented NADPH-cytochrome P450 reductase. SDS-PAGE/Western blot analysis revealed that the molecular weight of the protein forming the band was around 80 kDa, which was identical to that of rat NADPH-cytochrome P450 reductase. The intensity level of NADPH-diaphorase staining assigned to this enzyme estimated by this method increased four times in microsomal fractions prepared from rat fed ethanol chronically compared to that from controls. When a dilution series of a rat liver microsomal fraction was examined by this method and SDS-PAGE/Western blot analysis, their staining intensities representing this enzyme were significantly correlated with each other. Using the naive PAGE/NADPH-diaphorase staining method, NADPH-cytochrome P450 reductase is detected in rat liver microsomes. This method is beneficial because compared with the conventional SDS-PAGE/Western blot analysis, the quantification of NADPH-cytochrome P450 reductase in tissue samples is allowed to be more easily done.

用低G/C%含量引物通过PCR扩增家蝇细胞色素P-450 cDNA

根据昆虫细胞色素Ｐ－４５０基因的多型性和遗传多态性，以苯巴比妥钠诱导、室内饲养的杀虫剂敏感种群雌性家蝇ＭｕｓｃａｄｏｍｅｓｔｉｃａｖｉｃｉｎａＭａｃｑｕａｒｔ为材料，提取总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－纤维素亲和层析分离出总ｍＲＮＡ；以此为模板反转录合成总ｃＤＮＡ。再以总ｃＤＮＡ为模板，以Ｐ－４５０ＣＹＰ６Ａ１ｃＤＮＡ序列为参考设计一对低Ｇ／Ｃ％含量引物，进行ＰＣＲ扩增，获得１．５ｋｂ左右的预期目的片段。

[TPPFe(Ⅲ)]_2O的合成及其对细胞色素P-450的模拟

TPPFe（Ⅲ）Cl通过中性Al2O3色谱柱得到一个新化合物,它在HPLC中的保留时间比TPPFe（Ⅲ）Cl大得多,IR、UV-Vis和元素分析表明,这个新化合物是[TPPFe（Ⅲ）]2O.同TPPFe（Ⅲ）Cl一样,它具有在常温常压下催化碳氢化合物单充氧化的性质。[TPPFe（Ⅲ）]2O倦化下PhIO氧化环己烷的反应,在CH2Cl2和环己烷介质中,氧化产率分别为14.97和62.6％,高于TPPFe（Ⅲ）Cl作催化剂时的产率。在环己烷溶剂中,反应产率与反应时间呈线性关系,且反应有大约3小时诱导期。但在GH2Cl2溶剂中不存在反应产物与时间的线性关系,也不存在诱导期。与TPPFe（Ⅲ）Cl比较,[TPPFe（Ⅲ）]2O对氧化剂更稳定。上述事实表明,[TPPFe（Ⅲ）]2O能够作为细胞色素P-450的模型化合物。

细胞色素芳香化酶P-450在正常、子宫内膜异位症子宫内膜的表达及意义

目的 :探讨细胞色素芳香化酶P - 45 0在子宫内膜异位症 (内异症 )发病中的作用 ,检测子宫内膜细胞色素芳香化酶P - 45 0的表达用于诊断内异症的可行性。方法 :应用免疫组化方法检测正常子宫内膜和内异症的在位及异位内膜细胞色素芳香化酶P - 45 0的表达。结果 :细胞色素芳香化酶P - 45 0在正常子宫内膜无表达 ,在内异症的在位和异位内膜均有强表达 ,增殖期与分泌期无差别。检测子宫内膜细胞色素芳香化酶P - 45 0的表达 ,用于诊断内异症的敏感度为 91 5 % ,特异度为 10 0 % ,阳性预测值为 10 0 %。内异症子宫内膜细胞色素芳香化酶P - 45 0的表达与AFS分期无相关性。结论 :子宫内膜细胞色素芳香化酶P - 45 0分泌增加促进内异症的发生 ;内异症子宫内膜细胞色素芳香化酶P -45

以杯芳烃为基体的仿细胞色素P-450单加氧酶模型的合成

用对叔丁基杯［４］芳烃与卟啉羧酸的酰氯化物反应，并引入金属，合成了杯芳烃－金属卟啉仿细胞色素Ｐ－４５０单加氧酶模型Ａ，Ａ及前体化合物６的结构经ＩＲ，＾１ＨＮＭＲ，ＭＳ和元素分析确定，并确证Ａ中杯环呈“锥体”构象。

棉酚和烟碱对棉铃虫的生长和细胞色素P-450单加氧酶活性的影响

以人工饲料添加法测定了 0 5%的棉酚和烟碱对棉铃虫的生长和细胞色素P 4 50单加氧酶 (简称P 4 50酶系 )活性的影响。研究结果显示 ,在测定浓度下 ,高龄棉铃虫短期取食含棉酚和烟碱的人工饲料后 ,对幼虫的生长没有显著影响 ,由此表明 ,棉铃虫对其主要寄主植物中的次生物质棉酚和烟碱具有很好的适应能力。与此同时 ,棉铃虫中肠微粒体P 4 50酶系的蛋白组成和酶活性发生了不同的变化 ,有升有降 ,有的没有变化。棉铃虫可能通过调整P 4 50酶系的各种蛋白含量和酶的活力水平 ,来适应对植物次生物质的代谢解毒的需要。另外 ,棉铃虫取食棉酚和烟碱后 ,细胞色素B5含量均显著提高 ,而细胞色素P 4 50含量均显著降低 。

P-糖蛋白抑制剂HZ08对裸鼠体内肿瘤多药耐药逆转以及对大鼠肝P450酶影响(英文)

目的:考察P-糖蛋白抑制剂HZ08对K562/ADM接种裸鼠体内肿瘤多药耐药的逆转作用及HZ08对大鼠肝P450酶亚型的影响。方法:K562/ADM接种的裸鼠尾静脉注射HZ08和阿霉素4周,与对照组和阳性药组比较瘤重;HZ08与CYP450亚型特异性底物在大鼠肝微粒体中温孵,与对照组比较测定HZ08对于CYP450亚型的影响。结果:HZ08可显著减小裸鼠体内的瘤重,并对大鼠肝微粒体CYP3A4有较弱的抑制作用,对其他P450酶亚型无显著抑制作用。结论:HZ08在裸鼠体内具有较好的逆转P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药的作用,并且在体外实验中对P450酶具有较小的影响。

注射用丹参总酚酸(冻干)对人CYP450酶和P-糖蛋白体外抑制作用及对大鼠CYP1A2和CYP3A体内诱导作用(英文)

目的探讨注射用丹参总酚酸(冻干)(SLI)对人CYP450酶和P-糖蛋白体外抑制作用以及对大鼠CYP1A2和CYP3A体内诱导作用。方法①应用P450-GloTMCYP450检测试剂盒,通过化学发光法测定SLI和经典抑制剂对细胞色素P4501A2(CYP1A2),CYP2D6,CYP3A4,CYP2C19和CYP2C9的IC50值,通过比较SLI和经典抑制剂对相应细胞色素P450亚型的IC50值来判断SLI对人CYP450酶的体外抑制作用。②Wistar大鼠分别iv给予SLI 3,10和30 mg·kg-1和诱导剂苯巴比妥钠20 mg·kg-1,采用探针底物法,通过比较代谢产物的生成速率来评价SLI对大鼠CYP1A2和CYP3A的诱导作用。③应用ATP酶检测试剂盒,通过化学发光法测定ATP酶活性来评价SLI是否为P-gp的底物或抑制剂。结果①CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A4抑制剂的IC50与SLI对其的IC50进行比较(CYP1A2:0.12μmol·L-1vs 840μmol·L-1;CYP2C9:3.362μmol·L-1vs 704μmol·L-1;CYP2C19:3.236μmol·L-1vs 306μmol·L-1;CYP2D6:0.117μmol·L-1vs 2660μmol·L-1;CYP3A4:0.078μmol·L-1vs 1780μmol·L-1)。②与空白对照组(86.4±6.3)nmol·g-1.min-1相比,SLI 3,10和30 mg·kg-1组CYP1A2活性分别为83.4±6.6,82.5±4.0和(83.4±6.6)nmol·g-1.min-1。与空白对照组(16.1±0.9)nmol·g-1.min-1比较,SLI 3,10和30 mg·kg-1组CYP3A活性分别为15.7±0.6,15.9±0.7和(15.9±1.0)nmol·g-1.min-1,无显著性差异。③以临床血药浓度为依据设计的一系列浓度的SLI 0.0002,0.0006,0.002,0.006,0.017,0.052,0.156和0.468 g.L-1的ATP酶活性分别与空白对照组进行比较(5.8,5.3,5.8,5.5,5.8,5.2,,5.8,5.3,vs 5.75μmol·g-1.min-1),无显著性差异。结论SLI临床给药剂量既不能体外抑制人CYP1A2,CYP2D6,CYP3A4,CYP2C19和CYP2C9酶活性,也不能诱导大鼠CYP1A2和CYP3A,同时也不是P-gp的体外抑制剂或底物。

中草药对细胞色素P-450酶调控研究进展

对近 5年国内外关于中草药对细胞色素P 4 5 0酶调控的文献进行检索、整理分析和归纳总结 ,综述了有关中草药及其单体化合物对细胞色素P 4 5 0酶调控方面的研究进展并评述了对P 4 5 0酶调控的研究策略。提出加强中草药对P 4 5 0酶作用的研究有重要意义 ,有助于指导中药的安全合理应用和发现新药。

细胞色素P-450酶系的研究进展

细胞色素P-450酶系(简称P-450)因其在内源性和外源性的化学物质尤其对各种杀虫剂和环境有害化学物质的氧化代谢方面起着重要的作用,而受到广泛的重视。该酶系还在昆虫对杀虫剂的抗性机制以及选择毒性中,昆虫对寄主植物的适应性等方面都起着重要作用。

杯[6]芳烃-双金属卟啉仿P-450酶模型的研究 Ⅳ.对异丙苯氧化的催化行为

研究了杯[6]芳烃-双金属卟啉在氧化异丙苯中的催化行为,结果表明杯[6]芳烃-双金属卟啉比之相应的金属卟啉具有更高的催化活性,并表现同样的选择性,生成苯乙酮和醇组份.此一结果同通常酞菁或其它如西弗碱大分子金属络合物催化下生成丙酮和酚不同.还考察了温度、轴向配体、催化剂用量及金属离子种类等对反应的影响,仔细地通过测定反应速度比较了反应的活性.

NADPH-细胞色素P-450还原酶的制备及在外来化合物代谢中的作用

ＮＡＤＰＨ－细胞色素Ｐ－４５０还原酶是肝微粒体酶系的主要组成成分。本文报道了一种简单经济制备还原酶的方法，并通过ＮＡＤＰＨ的氧化证明还原酶及细胞色素Ｐ－４５０２Ｂ１重组酶系能代谢苯、二氯乙烯和石棉。但代谢过程中的中间产物未能引起质粒ＤＮＡ电泳图谱的变化。

担载金属卟啉模拟细胞色素P-450的催化丙烯环氧化

制备了SiO2化学键合金属卟啉Mn（TPP）Cl，Mn（TDCPP）Cl的担载配合物催化剂，并与单氧给体次氯酸钠（NaClO）构造了细胞色素P－450单加氧酶模拟体系，并考察了该体系的反应性能及其影响因素．金属卟啉经化学修饰的SiO2担载之后，由于表面官能团与金属中心的轴向配位及刚性载体SiO2对金属卟啉在载体表面很好的位置分离作用，使得金属卟啉的抗氧化性及稳定性显著增加，表现出优良的催化丙烯环氧化反应性能．

黄鳝P-450芳香化酶基因的克隆及序列分析

P-450芳香化酶(P450arom)是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本文采用RT-PCR和RACE(Rapid amplifi- cation of cDNA ends)法,首次分离和克隆了雌雄同体鱼黄鳝卵巢中P450 arom基因。该基因cDNA全长1802bp(不包 括poly(A)),5'端非翻译区有49bp,3'端202bp(不包含poly(A)),阅读框(Open reading frame,ORF)1551bp,翻译成517 个氨基酸,计算的蛋白质分子量58．2kDa。同源性分析显示,黄鳝卵巢P450arom的氨基酸序列与其他鱼卵巢 P450arom具有63％-80％同源性,与其他鱼脑P450arom为58％-60％同源,与人胚盘和鸡卵巢P450arom则为 50％-52％同源;但在芳香化酶高保守区(包括1-螺旋区,芳香化酶特异保守区和血红素结合区)的同源性高达 76％-92％。系统发育分析表明芳香化酶基因是单起源,黄鳝卵巢芳香化酶基因与鳉鱼卵巢的关系最近,与鱼类卵 巢P450arom属于同一分支的,与鱼类脑及鸡和人的属于不同分支。

地塞米松对大鼠肝脏微粒体细胞色素P-450的诱导效应

目的:观察地塞米松(dexamethasone,DEX)对细胞色素P-450(cytochrome P450,CYP450)的诱导效应,并探讨其诱导机制。方法:雄性Wistar大鼠分别以DEX 0,25,50和100mg·kg^(-1)·d^(-1)诱导处理(ip)4d后,测定大鼠肝脏总CYP450含量,CYP3A1,CYP3A2和CYP2B1/2的mRNA及蛋白的表达水平,肝脏ERD(CYP3A活性),PROD(CYP2B活性)和BROD(总CYP450活性)。结果:CYP450含量、ERD、PROD和BROD活性在DEX多次诱导后都有升高。CYP3A1 mRNA表达水平、蛋白含量和酶活性有明显的升高,剂量效应关系明显;CYP3A2蛋白明显升高,但mRNA表达水平却无明显变化。PROD和CYP2B1/2的mRNA表达水平以及总CYP450含量均在50mg·kg^(-1)·d^(-1)剂量组达到最高值。结论:DEX对雄性大鼠主要诱导CYP3A1和CYP3A2两个CYP450成员表达上调,对CYP2B1/2也有一定的诱导作用,其诱导作用主要表现在酶活性、酶蛋白含量和mRNA表达水平的升高。CYP3A1和CYP3A2的诱导方式可能不同。

罗格列酮对大鼠肝细胞色素P-4502E1活性的影响

目的 :探讨罗格列酮对细胞色素P 4 5 02E1活性的影响。方法 :在正常大鼠肝细胞微粒体中加入浓度为 0 ,0 .10 ,0 .2 5 ,0 .5 0 ,1.0 0mmol·L- 1罗格列酮 ,以N 二甲基亚硝胺为底物 ,测定细胞色素P 4 5 0 2E1活性。另外用 0 ,0 .2 ,2 ,2 0mg·kg- 1剂量的罗格列酮分别对用乙醇诱导和未用乙醇诱导的大鼠灌胃 ,然后取大鼠肝细胞微粒体 ,以N 二甲基亚硝胺为底物 ,测定细胞色素P 4 5 0 2E1活性。结果 :在体外试验中 ,加入不同浓度罗格列酮的大鼠肝微粒体中细胞色素P 4 5 0 2E1活性差异无显著意义。在体内试验中 ,给予不同剂量罗格列酮的大鼠的肝细胞色素P 4 5 0 2E1活性差异也无显著意义 ;结论 :罗格列酮对大鼠的肝细胞色素P 4 5 0

维拉帕米对FK 506肾毒性的防治作用与肾脏P-450的关系

通过对大鼠应用FK506及维拉帕米从而观察其对肝、肾P－450的影响。结果：FK506及CsA均使Bun和Scr升高，使用维拉帕米后BUN及Scr较FK506组低。FK506和CsA均致肾脏P－450含量升高，使用维拉帕米后肾脏P－450下降。而FK506和CsA均使肝P－450含量下降。实验证明：FK506具有肾毒性，FK506经肝脏代谢，且抑制肝脏微粒体中P－450的产生。FK506和CsA相似，也会引起肾脏P－450增多，这可能参与肾毒性，而维拉帕米致肾脏产生P－450减少，在这一环节亦起到防治肾毒性的作用。

大鼠肝脏微粒体中3种细胞色素P-450同工酶活性研究

目的 研究大鼠肝脏微粒体中CYP2D1/ 2、CYP2C11、CYP1A2 3种细胞色素P 4 5 0同工酶的活性。方法 用诱导剂和抑制剂分别在体内和体外调节大鼠肝脏P 4 5 0同工酶活性 ,并用高效液相法检测同工酶底物的特异性代谢产物来计算同工酶活性。结果 3种同工酶底物的特异性代谢产物的分离度达到了 1.5 ;天内、天间精密度均小于 10 .2 2 % ,天内、天间准确度均小于 14 .95 % ;相关系数都达到 0 .999。在体内腹腔注射地塞米松能使CYP1A2、CYP2D1/ 2、CYP2C11活性分别增加 1.3倍 (P <0 .0 5 )、1倍 (P <0 .0 1)和 2 .3倍 (P <0 .0 1)。β 萘黄酮可使CYP1A2活性增加 13.7倍 (P <0 .0 1)。在体外 ,呋拉茶碱可以不同程度地抑制CYP1A2、CYP2C11活性 ;普罗地芬、α 萘黄酮可以抑制CYP1A2活性 ;奎宁可以抑制CYP2D1/ 2活性。结论 甲苯磺丁脲、右美沙芬和非那西汀可以作为人体的探药 ,因而实验建立的方法有望用于检测人血浆或尿液中 3种探药的特定代谢产物 ,分别用于估测人肝脏CYP2C9、CYP2D6和CYP1A2的活性。