筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经NADPH氧化酶p22-phox亚基表达的影响

目的观察中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经NADPH氧化酶p22-phox亚基表达的影响。方法将STZ诱导的糖尿病大鼠随机分为模型组,维生素C组,筋脉通小、中、大剂量组,并设立正常对照组,连续灌胃16周。检测各组治疗前及治疗后4、8、12、16周的体重、血糖;测定第16周时大鼠机械痛阈值;采用免疫组化法测定大鼠坐骨神经NADPH氧化酶p22-phox亚基的表达,并进行半定量分析。结果与正常组相比,各组糖尿病大鼠体重均显著下降(P<0.01),血糖均明显升高(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠体重及血糖在各时间点均无显著差异(P>0.05)。与正常组相比,模型组、VC组、筋脉通小、大剂量组机械痛阈值显著降低(P<0.01);各治疗组机械痛阈值较模型组均明显升高(P<0.01);与VC组比较,筋脉通中剂量组机械痛阈值显著升高(P<0.01)。与正常组相比,模型组及各治疗组p22亚基的IOD值明显升高(P<0.05,P<0.01);各治疗组p22亚基的IOD值较模型组均显著降低(P<0.01);与VC组比较,筋脉通中、大剂量组p22亚基IOD值显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论筋脉通能显著降低大鼠坐骨神经NADPH氧化酶p22-phox亚基的表达。

p22-phox在P19细胞向心肌细胞分化前后的变化

目的探讨P19细胞向心肌细胞分化前后p22-phox水平的变化。方法贴壁培养P19细胞,取合适细胞株,应用0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导培养,收集诱导不同时间的细胞,通过Western blot检测其肌钙蛋白I(c Tn I)水平,以确定分化,并行Western blot检测P19细胞向心肌细胞分化前后细胞中p22-phox蛋白水平。结果1 P19细胞经0.9%DMSO诱导分化后,于第8天开始检测到c Tn I表达阳性,后c Tn I表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。2P19细胞向心肌细胞分化后细胞内p22-phox水平较分化前高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 p22-phox在P19细胞向心肌细胞分化后表达增加,氧化应激水平增高。

心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ作用中活性氧水平及p22^(phox)的表达

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预心肌成纤维细胞时活性氧的改变及可能的产生途径,为防治心室重塑发展提供思路。方法培养出生2～3d大鼠心肌成纤维细胞,分为正常对照组,AngⅡ(10-7mol/L)组,APO(100μmol/L)组,APO+AngⅡ(APO100μmol/L培养1h后加入终浓度10-7mol/LAngⅡ)组。干预48h后应用荧光显微镜观测活性氧水平;免疫组织化学法检测p22phox蛋白表达。结果AngⅡ组活性氧荧光最强,APO+AngⅡ组明显减弱,对照组和APO组最弱。组化染色结果显示对照组和APO组几乎未见p22phox蛋白阳性表达;AngⅡ组细胞普遍阳性表达,显著高于其他3组;APO+AngⅡ组稍强于对照组和APO组,但无显著性差异。结论AngⅡ可能通过增强p22phox蛋白表达,导致NADPH氧化酶途径产生活性氧增多。

P22^(phox)与PPAR-γ基因多态性与冠心病的关系

[目的]探讨细胞色素b24(5P22phox)C242T和过氧化体增殖物激活型受体-γ(PPAR-γ)C161T基因多态位点的基因型分布与冠心病危险性的关系。[方法]采用病例-对照研究,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分别检测P22phox和PPAR-γ基因型。[结果]总的研究人群中P22phox基因的C和T两种等位基因分布频率为92.72%和7.28%;携带CT+TT基因型的研究对象患冠心病的危险性降低(OR=0.45,95%CI:0.23~0.87);在PPAR-γ基因中TT基因型者在冠心病组和对照组的分布分别为15.23%和24.01%,两组比较差异有显著性(P<0.05);TT基因型者患冠心病的危险性降低(校正OR=0.49,95%CI:0.25~0.98);与携带PPAR-γCC基因型且P22phoxCC基因型个体相比,具有PPAR-γCT基因型且P22phoxCT+TT基因型的个体患冠心病的危险性降低(校正OR=0.24,95%CI:0.07~0.85,P<0.05)。[结论]携带P22phoxCT+TT基因型和PPAR-γCT基因型的个体,患冠心病的危险性降低。

氨氯地平和缬沙坦对人冠状动脉内皮细胞NADPH氧化酶亚基gp91^(phox)和p22^(phox)表达的影响

目的研究不同浓度的氨氯地平和缬沙坦对人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基gp91phox和p22phox的影响。方法对照组:体外贴壁培养HCAEC,不进行其他干预;实验组:相同培养条件下分别加入不同浓度氨氯地平(1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L)和不同浓度缬沙坦(1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L)体外培养24 h。提取各组细胞的膜蛋白,应用Western blot法测两组细胞中p22phox和gp91phox的表达水平,对结果进行统计分析并比较。结果不同浓度氨氯地平对HCAEC内NADPH氧化酶亚基p22phox表达均有促进作用(P<0.05),高浓度氨氯地平对gp91phox有抑制作用(P<0.05),低浓度则会促进gp91phox的表达(P<0.05)。不同浓度缬沙坦对p22phox与gp91phox的表达均有显著的抑制作用(P<0.05),且有随着药物浓度增高抑制作用增强的趋势(P<0.05)。结论缬沙坦有抑制氧化应激的效力,并随浓度增高而增强,呈现浓度依赖的趋势;氨氯地平仅在高浓度时抑制部分NADPH氧化酶亚基(gp91phox)的表达,低浓度时反而可能增加氧化应激水平。

川崎病患儿治疗前后外周血单核细胞P_(22)phox表达的变化及其临床意义

目的探讨川崎病急性期患儿治疗前后外周血单核细胞中P_(22)phox mRNA表达的变化及其临床意义。方法 2015年10月至2016年6月川北医学院附属医院儿科收治住院的川崎病患儿40例,其中有冠脉损害者15例,无冠脉损害者25例。同期选择本院小儿外科择期手术患儿20例为正常组。采取荧光实时定量RT-PCR法分别测定40例川崎病患儿治疗前后和正常组儿童外周血单核细胞中P_(22)phox mRNA表达的水平。结果川崎病组治疗前后P_(22)phox mRNA的表达比较差异有统计学意义(P<0.05);川崎病组治疗前与正常组P_(22)phox mRNA的表达比较差异有统计学意义(P<0.01);川崎病组治疗后与正常组P_(22)phox mRNA的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前有无冠脉损害、治疗后有无冠脉损害、治疗前后有冠脉损害以及治疗前后无冠脉损害P_(22)phox mRNA表达的比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 P_(22)phox可能参与川崎病急性期的发病机制。

辛伐他汀对内皮细胞NADPH氧化酶表达和活性氧生成的影响

目的探讨辛伐他汀对内皮细胞NADPH氧化酶表达及活性氧生成的影响。方法以不同浓度辛伐他汀和10-8mol.L-1辛伐他汀不同处理时间培养内皮细胞,用RT-PCR检测NADPH氧化酶各亚单位(NOX4、NOX2、p67phox、p22phox、RAC)表达的变化;用流式细胞仪检测细胞内活性氧的浓度。结果辛伐他汀能下调NOX4、p67phox、p22phoxmRNA表达,同时下调细胞内活性氧浓度。结论辛伐他汀可能通过下调NADPH氧化酶表达,以减少活性氧生成从而达到抗氧化损伤作用。

红杉醇对2型糖尿病大鼠肝病NADPH氧化酶亚单位p22 phox和p47 phox表达的影响

探讨红杉醇对2型糖尿病大鼠肝病NADPH氧化酶亚单位p22 phox和p47 phox表达的影响。采用高脂高糖饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病大鼠肝病模型,红杉醇(50、25及12.5 mg.kg 1.d 1)治疗6周。于末次给药后测定血糖、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢(H2O2)、NO和胰岛素(Ins)的含量;real-time PCR测定肝脏p22 phox和p47phox mRNA表达;Western blotting法测定p22 phox和p47 phox蛋白表达,HE染色观察肝脏病理变化。结果发现,红杉醇各剂量组能降低模型大鼠空腹血糖、ALT、AST、Ins和H2O2含量,恢复胰岛素敏感指数(ISI)及体重,升高肝组织T-AOC和NO含量;降低肝组织NADPH氧化酶亚单位p22 phox和p47 phox mRNA及蛋白表达,改善肝细胞病理改变(水肿、点状或灶状坏死及炎症细胞浸润)。上述结果表明,红杉醇可通过降低NADPH氧化酶表达进而改善2型糖尿病大鼠肝病的氧化应激损伤。

苯那普利与坎地沙坦减轻自发性高血压大鼠主动脉内皮氧化应激

目的观察苯那普利、坎地沙坦治疗对自发性高血压大鼠(SHR)主动脉内皮氧化应激以及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、NAD(P)H 氧化酶重要亚单位 P22^(phox)表达的作用。方法 12周龄 SHR(n=9)连续灌胃给予苯那普利[10 mg/(kg·d),n=9]或(和)坎地沙坦[4 mg/(kg·d),n=9],每2周测定尾动脉压。12周后检测主动脉病理结构、血清超氧化物歧化酶(SOD)活力、一氧化氮(NO)和羟自由基的含量、血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和环鸟苷酸(cGMP)水平、主动脉内膜 eNOS 和 P22^(phox)的表达。结果 SHR 主动脉血管壁明显增厚,尾动脉压、血清羟自由基、血浆 AngⅡ水平及主动脉 P22^(phox)的表达均显著增高,而血清 SOD 活力、NO 含量、cGMP 水平及血管组织 eNOS 的表达均降低。应用苯那普利(Ben)、坎地沙坦(Can)单独治疗均可改善自发性高血压大鼠主动脉结构,增加血清 SOD 活力[Ben:(68.7±2.1),Can:(65.6±4.2)比 SHR:(48.8±3.2)U/mL,P<0.01]、NO 含量[Ben:(60.2±3.5),Can:(58.3±4.4)比 SHR:(42.7±2.9)μmol/L,P<0.01]、血浆 cGMP 含量[Ben:(8.7±1.3),Can:(8.0±1.2)比 SHR:(5.0±1.1)pmol/mL,P<0.01]及主动脉 eNOS 表达[Ben:(1.1±0.3),Can:(1.1±0.2)比 SHR:(1.0±0.2),P<0.01],减少血清羟自由基量[Ben:(422±27),Can:(428±39)比 SHR:(616±50)U/mL,P<0.01和 P<0.05]及主动脉 P22^(phox)的表达[Ben:(1.0±0.2),Can:(1.1±0.2)比SHR:(1.7±0.4),P<0.01];两药联用[苯那普利5 mg/(kg·d)+坎地沙坦2 mg/(kg·d)]能增加 NO 含量及eNOS 表达、降低 P22^(phox)表达,虽然与两药单独使用没有统计学意义,但是在增加 SOD 活力[(71.6±4.2)U/mL]、cGMP 含量[(10.2±1.2)pmol/mL]及减少羟自由基含量[(399±50)U/mL]效果较好(与 Can 组相比,P<0.05)。结论苯那普利和(或)坎地沙坦单用均能够改善 SHR 主动脉结构及氧化应激状态,两者联合应用具有部分协同作用。

血管紧张素Ⅱ对高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞增殖、p22^(phox)及活性氧的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对正常血压和高血压患者的肠系膜动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及细胞内NADPH氧化酶-活性氧信号传导通路的影响。方法选取开腹手术正常血压和高血压患者肠系膜动脉培养的二至四代人VSMC作为标本,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别测定细胞增殖率、细胞内活性氧及p22phox蛋白mRNA的表达。结果①与空白对照组比较,孵育组的细胞增殖率、细胞内活性氧物质生成量、细胞内p22phoxmRNA的表达均明显增高(均P<0.01)。②与正常血压组比较,给予AngⅡ刺激后,高血压患者的肠系膜动脉VSMC增殖率和细胞内p22phoxmRNA的表达量均明显增高(均P<0.01)。结论AngⅡ对高血压患者肠系膜动脉VSMC促细胞增殖作用较正常血压者更强。

血管紧张素转换酶2基因转染对人血管内皮细胞中氧化应激水平的影响

背景血管紧张素转换酶2(ACE2)是迄今为止发现的人类 ACE 的第一个同源基因,是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的主要降解酶,但其在氧化应激中的调控作用尚不清楚。目的探讨重组 ACE2基因转染对体外培养人血管内皮细胞中由 AngⅡ诱导的 NAPDH 氧化酶 p22^(phox)表达和丙二醛(MDA)水平的影响。方法克隆和构建含人 ACE2基因全长的重组质粒(pACE2),并将之转染人人血管内皮细胞中。分别采用实时定量 PCR 和 Western印迹技术检测转染细胞中的 p22^(phox)的 mRNA 与蛋白表达情况。采用硫代巴比妥酸比色法测定细胞中 MDA 含量。结果 AngⅡ(100 nmol/L)和 AngⅣ(100 nmol/L)刺激后均可诱导人内皮细胞中 p22^(phox)的 mRNA 及蛋白表达大大增加,伴有细胞中 MDA 水平升高(n=6,P 均<0.01)。pACE2基因转染可抑制细胞中由 AngⅡ和 AngⅣ诱导的 p22^(phox)表达,同时伴 MDA 水平下调(n=5～6,P 均<0.01)。结论 ACE2基因过表达可明显抑制人内皮细胞中 p22^(phox)的表达,而且降低 MDA 水平,提示 ACE2具有一定的抗氧化效应。通过调节 ACE2基因活性和表达,很可能成为氧化应激相关疾病如高血压病防治的重要手段。

4羟基2.2.6.6四甲基哌啶对肾性高血压大鼠主动脉重构的影响

背景线粒体是活性氧产生的主要来源之一,4羟基2.2.6.6四甲基哌啶(Tempol)可作用于线粒体,清除活性氧。目的探讨Tempol对肾性高血压大鼠主动脉功能和结构的影响以及作用机理。方法两肾一夹的方法建立肾性高血压大鼠模型,术后4周随机分为假手术组(n=8)、高血压组(n=6)及治疗组(n=6),治疗组给予含Tempol 1 mmol/L饮用水。干预8周后观察血压、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、一氧化氮(NO)、8异前列腺素F_(2α)、胸主动脉NADPH氧化酶亚单位p22 phox mRNA表达的变化;对胸主动脉进行离体血管环实验和HE染色观察其舒张功能和结构的变化。结果1)模型高血压组与假手术组比较,血压、主动脉中膜厚度、中膜厚度/内径显著增加(P均<0.01);AngⅡ、8异前列腺素F_(2α)、NO显著降低(P均<0.01);离体主动脉环对乙酰胆碱(Ach)引起的最大舒张百分数显著下降(P<0.01);主动脉NADPH p22 phox mRNA表达上调。2)治疗组用Tempol治疗8周后与高血压组比较,血压、主动脉中膜厚度、中膜厚度/内径下降;AngⅡ、8异前列腺素F_(2α)显著下降(P均<0.01);NO水平上升(P<0.05);离体主动脉环对Ach引起的最大舒张百分比显著上升(P<0.01);主动脉p22 phox mRNA表达下调;AngⅡ比较没有差异。3)各组间离体主动脉环对硝普钠引起的最大舒张百分比无差异;用L硝基精氨酸甲酯(L-NAME)抑制NO后,各组间离体主动脉环对Ach最大舒张反应无差异。结论Tempol可以明显降低肾性高血压大鼠中氧化应激水平,改善NO代谢,降低血压,其降压机制与其改善NO代谢有关,Tempol还可下调主动脉p22 phox mRNA表达改善主动脉内皮依赖性的舒张功能。

玉夏胶囊对自发性高血压大鼠心肌损伤的保护作用

目的:观察玉夏胶囊对自发性高血压大鼠(SHR)心肌i NOS、NADPH氧化酶亚单位p22^(phox)和p47^(phox)表达的影响,探讨玉夏胶囊对SHR心肌损伤的保护作用机制。方法:14周龄雄性SHR 28只,随机分为SHR模型组[0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5 m L/kg]、玉夏胶囊高、中、低(0.6、0.3、0.15 g/kg)剂量组,每组7只。另设WKY(0.5%CMC-Na 5 m L/kg)正常对照组7只。各组每日灌胃1次,连续10周,于给药前和末次给药后尾袖法测定血压;比色法测定心肌组织SOD、MDA、T-AOC及H2O2的含量;硝酸还原酶法测定心肌组织NO含量;免疫组化法表达心肌诱导型一氧化氮合酶(i NOS)阳性细胞;Western Blot表达心肌组织i NOS、p22^(phox)及p47^(phox)蛋白。结果:玉夏胶囊随着剂量的增加,能显著降低SHR的血压(P<0.05或P<0.01),减少SHR心肌组织MDA、H2O2及NO的含量(P<0.05或P<0.01),提高SOD和T-AOC的含量(P<0.05或P<0.01),抑制心肌i NOS阳性细胞表达,下调心肌i NOS、p22^(phox)和p47^(phox)蛋白(P<0.05或P<0.01)。结论:玉夏胶囊具有抗SHR心肌氧化应激的作用,其机制可能与下调心肌i NOS及p22^(phox)、p47^(phox)所介导的氧化应激损伤有关。

降糖通络汤对DPN大鼠NGF mRNA表达的影响及对雪旺细胞抗氧化、抗凋亡作用机制研究

目的:观察降糖通络汤对实验性糖尿病大鼠周围神经病变(DPN)治疗作用,并通过促进NGF、抗氧化、抗凋亡的环节对其作用机制予以研究。方法:采用静脉注射链脲佐菌素60mg/kg制备DPN模型,按血糖随机分为模型对照组、降糖通络汤36、18、9g生药/kg组、盐酸二甲双胍+甲钴胺分散片对照组(细胞实验为金芪降糖片),给药8周,1次/d。观察给药后2、8周空腹血糖及光热辐射痛阈变化,免疫组织化学测定坐骨神经的神经生长因子(NGF)蛋白表达、RT-PCR法测定NGF m RNA表达。IF测定高糖培养SC细胞中诱导型一氧化氮合成酶(i NOS)表达、RT-PCR法测定高糖培养雪旺细胞还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶p22-phox亚基表达。RT-PCR法测定细胞Casepase-3 m RNA、Bcl-2 m RNA表达,TUNEL法测定雪旺细胞凋亡。结果:降糖通络汤36、18g生药/kg组可明显降低空腹血糖(P<0.01),缩短对热光源刺激的躲避潜伏期(P<0.01)。促进坐骨神经NGF m RNA表达(P<0.01),抑制细胞核i NOS、NADPH p22-phox m RNA表达(P<0.01)、抑制Casepase-3 m RNA表达(P<0.01)、促进Bcl-2 m RNA表达(P<0.01),抑制凋亡率。结论:降糖通络汤通过促进NGF、抑制氧化应激、控制凋亡发挥对周围神经病变的治疗作用。

核心蛋白聚糖在胰腺癌beta细胞功能中的作用及对线粒体分离融合的影响

目的探究核心蛋白聚糖(DCN)在胰腺癌组织中的表达及对胰岛beta细胞线粒体分离融合的影响。方法征集21例胰腺导管腺癌(PDAC组)、25例胰腺神经内分泌肿瘤(PNET组)和4例健康者(健康组)胰腺组织;免疫组织化学检测胰腺组织中DCN表达;免疫荧光法检测胰腺组织中线粒体融合蛋白2(MFN2)和动力相关蛋白1(DRP1)表达情况;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测胰腺组织中DCN、线粒体分裂因子(MFF)、MFN1、MFN2、视神经萎缩症蛋白1(OPA1)、DRP1和线粒体分裂蛋白1(FIS1)表达;CCK-8法检测正常糖培养条件下DCN(0、1、10、100和200 nmol/L)处理对人胰岛β细胞(0、12、24和48 h)增殖的影响;胰岛β细胞分为2组:正常糖和高糖(HG)培养,均分别采用0 nmol/L和100 nmol/L DCN处理细胞24 h,CCK-8法再次检测各组细胞增殖,Annexin V/PI染色检测各组细胞凋亡,酶联免疫吸附实验检测各组细胞培养上清液中胰岛素分泌量,Western blot法检测MFF、MFN1、MFN2、OPA1、DRP1、FIS1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(P22^(phox))、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38亚基(p-p38)、p38、胰岛素样生长因子Ⅰ受体蛋白(IGFIR)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和AKT的表达。结果与健康组比较,PDAC和PNET组癌组织中DCN、DRP1、FIS1和MFF表达水平明显降低,MFN1、MFN2和OPA表达水平明显升高(P<0.05);在正常糖条件下,100 nmol/L和200 nmol/L DCN处理24 h和48 h的细胞增殖倍数均明显高于对应时间点的0 nmol/L DCN组,且具有时间和剂量依赖性(P<0.05);在正常糖和HG条件下,100 nmol/L DCN组的细胞增殖倍数均明显高于0 nmol/L DCN组(P<0.05);在正常糖和HG条件下,100 nmol/L DCN组的AnnexinV^(+)PI^(-)细胞比例较0 nmol/L DCN组无明显变化(P>0.05);无论正常糖或是HG条件下,0 nmol/L DCN组IGFIR表达水平与100 nmol/L DCN组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);在正常糖条件下,100 nmol/L DCN组的培养上清液中胰岛素分泌量,细胞中DRP1、FIS1、MFF、P22^(phox)、p-p38和p-AKT表达水平明显高于0 nmol/L DCN组(P<0.05),MFN1、MFN2和OPA表达水平低于0 nmol/L DCN组(P<0.05);在HG条件下,100 nmol/L DCN组培养上清液中胰岛素分泌量,细胞中P22^(phox)和p-p38表达明显高于0 nmol/L DCN组(P<0.05),DRP1、MFN2和OPA表达明显低于0 nmol/L DCN组(P<0.05)。结论DCN可通过激活P22^(phox)/MAPK通路调控胰岛β细胞的增殖、胰岛素分泌和线粒体融合分裂。