Porcine Immunoglobulin Fc Fused P30/P54 Protein of African Swine Fever Virus Displaying on Surface of S. cerevisiae Elicit Strong Antibody Production in Swine

African swine fever virus(ASFV)infects domestic pigs and European wild boars with strong,hemorrhagic and high mortality.The primary cellular targets of ASFV is the porcine macrophages.Up to now,no commercial vaccine or effective treatment available to control the disease.In this study,three recombinant Saccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae)strains expressing fused ASFV proteins-porcine Ig heavy chains were constructed and the immunogenicity of the S.cerevisiae-vectored cocktail ASFV feeding vaccine was further evaluated.To be specific,the P30-Fcγand P54-Fcαfusion proteins displaying on surface of S.cerevisiae cells were produced by fusing the Fc fragment of porcine immunoglobulin IgG1 or IgA1 with p30 or p54 gene of ASFV respectively.The recombinant P30-Fcγand P54-Fcαfusion proteins expressed by S.cerevisiae were verified by Western blotting,flow cytometry and immunofluorescence assay.Porcine immunoglobulin Fc fragment fused P30/P54 proteins elicited P30/P54-specific antibody production and induced higher mucosal immunity in swine.The absorption and phagocytosis of recombinant S.cerevisiae strains in IPEC-J2 cells or porcine alveolar macrophage(PAM)cells were significantly enhanced,too.Here,we introduce a kind of cheap and safe oral S.cerevisiae-vectored vaccine,which could activate the specific mucosal immunity for controlling ASFV infection.

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

【目的】获得可溶性非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p54蛋白和抗p54蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb),并分析其识别的线性抗原表位,为p54蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础。【方法】构建了重组原核表达质粒pET-21a-E183L,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,表达并利用Ni2+柱和分子筛纯化得到p54重组蛋白。以该蛋白为抗原免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠,每两周免疫一次,共免疫3次,首免时将p54蛋白与弗氏完全佐剂混匀乳化(150μg/只),二免、三免使用弗氏不完全佐剂。三免7 d后对小鼠进行尾部采血,使用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,选取效价高的小鼠进行加强免疫。3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,利用重组p54蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的mAb细胞株,并制备腹水。以pCAGGS-Flag-E183L质粒转染的HEK293T细胞和ASFV Pig/HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)为抗原,以筛选得到的mAb为一抗,进行Western blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。使用单抗亚类鉴定试剂盒检测该mAb重链和轻链类型。随后,将p54蛋白逐步截短并与GST标签融合表达后进行Western blot检测,鉴定该mAb识别的抗原表位。【结果】将构建的原核表达质粒pET-21a-E183L(54-183aa)转化至BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG进行诱导后,p54重组蛋白大部分以可溶的形式在上清中表达,分子量约为17 kDa。以纯化得到p54重组蛋白免疫小鼠,三免后7 d的血清效价为1:409 600,可进行细胞融合,经四次筛选和亚克隆后,获得能够稳定分泌p54蛋白mAb的细胞株,命名为5B11,成功制备腹水并纯化。Western blot和IFA试验结果显示,制备的mAb能够特异性识别HEK293T细胞中表达及ASFV感染PAMs中的p54蛋白。mAb亚类鉴定结果显示重链类型为IgG1型,轻链类型为κ链。该mAb识别的抗原表位序列为^(80)VTPQPGTSKPA^(90)。【结论】利用原核表达体系可溶性表达了ASFV p54蛋白的第54-183位氨基酸,并以纯化的蛋白为抗原制备了抗p54蛋白的mAb,并对其识别的抗原表位进行鉴定,丰富了p54蛋白的抗原表位信息,为ASFV血清学检测提供了基本材料。

非洲猪瘟病毒P54蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立

【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P54,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的P54蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种间接ELISA方法,对包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育等反应条件进行优化后,对其临界值、特异性、灵敏性和重复性进行验证。【结果】SDS-PAGE结果显示,P54蛋白分子质量为42 ku,纯度在95%以上;Western blotting结果显示,P54蛋白与ASFV阳性血清能产生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:0.3125μg/mL抗原37℃包被1 h,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,1∶800稀释的血清37℃孵育2 h,1∶15000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h。该ELISA检测方法仅与ASFV阳性血清产生特异性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和乙型脑炎病毒的阳性血清均无明显交叉反应;该方法灵敏性较高,ASFV阳性血清稀释度为1∶3200时仍有明显反应。批间重复和批内重复变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其阳性符合率为95.45%,阴性符合率为96.05%,总符合率为95.83%。【结论】本研究建立了一种以ASFV P54蛋白为检测抗原的ASFV间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的快速诊断提供更多选择。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单抗制备及B细胞线性抗原表位鉴定

以原核系统表达的非洲猪瘟病毒p54重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了3株能够稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为2A4、5F6和RH15。3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类,轻链均为Kappa型。Western blot和免疫荧光试验(IFA)证明3株单克隆抗体具有良好的反应性,可以用于靶抗原的特异性检测。通过噬菌体展示肽库筛选,确定了单克隆抗体2A4、5F6识别的抗原表位为^(157)NTASQ^(161),RH15识别的抗原表位为^(170)RQRNTYTHKDL^(180),进一步完善了靶抗原的B细胞线性抗原表位信息。

非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为进一步深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列(登录号:NC_001659.2)设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。

非洲猪瘟病毒p54蛋白的高效表达及在ELISA中的应用

本研究旨在高效原核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白,并进一步将其用于ELISA试验研究。参考非洲猪瘟病毒Con09/Bzz020株P54基因(E183L)的核苷酸序列,通过序列优化后合成P54基因,克隆至表达载体pET-30c(+),构建重组质粒pET-30c(+)-p54。结果显示,pET-30c(+)-p54有完整的阅读框架,可高效表达分子量约20.7ku的p54蛋白,该蛋白表达稳定,具有可溶性,易于纯化,纯度高达900μg·mL-1,所表达的p54蛋白的氨基酸序列与Con09/Bzz020株p54蛋白氨基酸序列相同;Western blot试验显示,表达的p54蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性反应;ELISA试验显示,p54蛋白针对ASFV阳性血清和阴性血清的P/N值为4.67。研究结果证实p54蛋白表达产量高,易于纯化,具有较好的抗原性,可用于非洲猪瘟ELISA诊断。

非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位预测及鉴定

为鉴定非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的B细胞线性抗原表位,本研究利用生物信息学方法结合抗原指数对ASFV p54蛋白进行抗原表位的预测,人工合成预测的抗原表位多肽,利用ASFV阳性血清以及特异性单克隆抗体(MAb),采用间接ELISA和阻断ELISA方法验证所预测抗原表位多肽的免疫学特性。预测结果显示,可能的抗原表位区域有:aa23-aa29,aa36-aa45,aa72-aa94,aa114-aa120,aa124-aa130,aa137-aa150。间接ELISA试验表明aa23-aa29,aa36-aa45,aa72-aa94,aa114-aa120,aa137-aa150多肽的抗原性较好,其中aa36-aa45,aa72-aa94多肽可以分别与两株杂交瘤细胞分泌的MAb发生特异性反应,本研究为ASF多肽疫苗及免疫学临床诊断方法的建立奠定基础。

非洲猪瘟病毒p54抗原C端的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒核心抗原p54蛋白C末端55个氨基酸的肽段(命名为p54-2),制备了多克隆抗体并进行了纯化,以进一步用于非洲猪瘟ELISA试剂盒的研发。将PCR扩增获得的p54-2目的片段与表达载体pGEX6p-1质粒均经过限制性内切BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建pGEX6p-1-ASFV-P54-2原核表达质粒。将该质粒转化到大肠埃希菌BL21中,诱导蛋白大量表达,并纯化获得高纯度的蛋白。将纯化的p54-2蛋白免疫小鼠,获得p54-2多克隆抗体并进一步纯化多抗。用ELISA、Westernblot对纯化的多克隆抗体进行效价滴定及特异性鉴定。结果显示,成功构建了pGEX6p-1-ASFV-P54-2重组质粒,在大肠埃希菌中IPTG诱导下,能够高效表达重组p54-2蛋白。用p54-2蛋白免疫Balb/c小鼠获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128000,说明该蛋白有很好的免疫原性。Westernblot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别非洲猪瘟病毒p54胞内区,具有较高反应性和特异性,可以用于ELISA检测方法研究和p54抗原表位的鉴定。

非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备

为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。

基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明^(146) PAEPYTT ^(152)为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2μg·mL^(-1)),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05%PBST溶液稀释5000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。

EB病毒融合蛋白Zta-P54在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

为获得能用于检测试剂盒的高纯度具有活性的EB病毒融合蛋白,以pGEX5T-BZLF1-BMRF1质粒为模板进行PCR扩增得到BZLF1-BMRF1融合基因,将其插入pET32a中,构建表达质粒pET32a/BZLF1-BMRF1。将该质粒转入大肠杆菌培养,经IPTG诱导获得Zta-P54融合蛋白。用DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Western blot对Zta-P54融合蛋白进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果显示成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,SDS-PAGE显示该蛋白相对分子量约为60kD,与预期结果一致。纯化后获得纯度为96.5%的Zta-P54融合蛋白。Western blot检测该蛋白有良好的生物活性和反应特异性。因此,成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,在大肠杆菌中可溶性表达。最终获得纯度高、生物活性好的融合蛋白。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示:成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,特异性强,所获抗体均识别p54蛋白C端127—146 aa肽段。本研究成功获得了ASFV p54蛋白和p54单克隆抗体,并鉴定了6株单克隆抗体的抗原表位,为p54蛋白功能研究和ASFV新型表位疫苗研究奠定了基础。

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的原核表达与反应原性鉴定

p54蛋白为非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要结构蛋白之一,参与病毒对靶细胞的吸附与进入。为深入研究p54结构蛋白的抗原性,根据GenBank序列号(MK128995)对应的E183L基因序列,设计1对特异性引物扩增其整个CDS区,并克隆至pET-30a(+)载体,构建了表达p54蛋白的重组质粒pET-30a(+)-p54。用BL21(DE3)转化该质粒,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳,可见重组质粒表达出1条分子量约为20 kDa的特异性条带,且重组表达蛋白以融合表达蛋白形式存在于上清。进一步通过His亲和层析法纯化目的蛋白,用ASFV阳性血清进行蛋白质免疫印迹反应,发现表达的重组p54蛋白能与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明p54蛋白表达成功。本研究为ASFV抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础。

非洲猪瘟病毒p54蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究以ASFV Pig/HLJ/18分离株基因组DNA为模板扩增tE183L基因片段,构建重组原核表达质粒pET-21a-tE183L。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达可溶性p54蛋白,并将采用镍亲和层析柱和分子筛纯化的p54与弗氏佐剂等比混合后免疫新西兰大白兔,采集血清经Protein G亲和层析纯化得到兔抗p54多克隆抗体。研究结果表明,构建的原核表达质粒p ET-21a-t E183L可成功表达p54蛋白且纯度较高。Western blot、间接免疫荧光和免疫沉淀试验结果显示,纯化的抗p54多克隆抗体能特异性识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-ASFV p54蛋白和ASFV感染肺泡巨噬细胞(PAMs)后表达的ASFV p54蛋白。本研究成功表达和纯化p54可溶性蛋白;制备的多克隆抗体有良好的特异性,这为深入探讨ASFV p54蛋白的生物学功能奠定了基础。

烟草花叶病毒P54基因的原核表达与蛋白纯化

【目的】烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)编码的与复制相关通读P183基因中,编码一个P54基因,其功能及其作用分子机制还鲜见报道。为获得P54蛋白纯化样品开展本研究,以期为P54蛋白的功能及其作用分子机制研究奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术,从感染TMV的三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)cDNA中扩增获得片段大小为1425 bp的烟草花叶病毒P54基因,并克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1,转化E coli BL21(DE3)中进行诱导表达,包涵体透析复性后采用Ni-NTA柱层析纯化,Western-blotting进行鉴定。【结果】原核表达的TMV P54蛋白,主要以包涵体的形式存在;复性后经Ni-NTA柱层析纯化,SDS-PAGE表明纯化蛋白为一分子量约为60 kDa的单一条带。Western-blotting结果证实纯化蛋白为P54重组蛋白。【结论】本研究纯化得到了重组P54蛋白,为进一步深入研究P54蛋白的功能奠定基础。

非洲猪瘟病毒截短p54蛋白的原核表达与纯化

旨在高效表达可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白。去除可能影响p54蛋白可溶性表达的前50个氨基酸(aa),根据GenBank收录的ASFV p54基因序列设计引物,从第51个aa对应的基因序列起用PCR扩增截短的p54基因,并用分子克隆方法插入到带有TF及His标签的冷休克表达载体pCold TF上,构建pCold TF-p54重组质粒。经菌液PCR及测序验证后将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达p54重组截短蛋白,对IPTG诱导浓度、诱导时间进行优化,并对纯化重组蛋白时所用洗脱液的咪唑浓度进行探索。Western blot鉴定p54重组截短蛋白的反应原性,并探究TF标签对于该蛋白反应原性的影响。结果表明,成功构建了pCold TF-p54重组质粒,经终浓度为1 mmol/L的IPTG于16℃诱导9 h时,p54重组截短蛋白的表达量最高,分子质量约为76 ku。经50 mmol/L咪唑洗脱液洗脱可得到较纯的p54重组截短蛋白,经人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV)3C Protease切除TF及His标签后,再次纯化可得到无标签且高纯度的p54截短蛋白。Western blot结果显示无标签的p54截短蛋白及有标签的p54重组截短蛋白均可被ASFV p54单克隆抗体特异性识别,均具有反应原性,且p54重组截短蛋白还可被ASFV阳性血清特异性识别。研究证实了原核表达的p54重组截短蛋白兼具可溶性、良好的反应原性,且重组蛋白上的TF标签不影响抗体对p54蛋白的识别,因此可用于后续ASFV抗体检测方法的研发。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法。采用原核表达的ASFV p54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价。结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0μg·mL^(-1),抗原包被温度及时间为4℃过夜,被检血清稀释度为1∶40,酶标单抗稀释度为1∶1000,被检血清作用时间为1 h,酶标单抗作用时间为30 min,底物作用时间为10 min。经阴、阳性样品检测和特异性、敏感性试验,当临界值阻断率≥55.2%时,判定为阳性,当阻断率<43.4%时,判定为阴性,介于两者之间判定为可疑。该方法与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应,特异性好。批内重复试验及批间重复试验的变异系数(CV)均在10%以内。将该方法进行初步应用,并与商品化ELISA试剂盒进行符合性试验,两者的检测符合率为98%。综上表明,建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV临床样品的抗体检测。

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK_((l+r)),参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK_((l+r))-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数(MOI)PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK_((l+r))-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为10^(7.34)/0.1 mL和10^(7.61)/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。

非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的Bacmid-p54质粒DNA转染Sf9细胞,出现明显病变后,收获细胞培养上清,在正常Sf9细胞中传三代,获得的杆状病毒命名为rBac-P54。利用SDS-PAGE检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western-blot鉴定p54蛋白的免疫原性。结果显示,在感染的Sf9细胞中,p54蛋白能获得高效表达,并可被ASFV阳性血清特异性识别。这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性,为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白,参与病毒的早期感染,具有较强的免疫原性,常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54),采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示,rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带,经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠,三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫,3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示,三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000,表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示,获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性,采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示,3株MAb均在17 ku处出现特异性条带;IFA结果显示,以3株MAb作为一抗的表达p54蛋白的HEK293T细胞出现绿色荧光,而未转染质粒的阴性对照细胞无绿色荧光;间接ELISA结果显示,3株MAb仅与p54蛋白反应,而与其它猪源病毒蛋白均无反应。上述结果表明,本研究获得具有良好免疫原性的rp54,并制备了3株p54 MAb,且3株MAb的反应原性及特异性均较强,本研究为开发ASFV的检测技术和开展该病毒的生物学研究提供了生物材料。