NF-κB p50和p65蛋白保守结构域原核表达系统的建立

目的 为了获得具有DNA结合活性的人NF κBp5 0和p65蛋白 ,建立人NF κBp5 0和p65蛋白保守结构域的原核表达系统。方法 通过PCR法扩增获得人NF κBp5 0和p65蛋白保守结构域的cDNA ,后分别将其克隆到原核表达载体pET 2 2b( +)上 ,转化E .coliBL 2 1,经诱导表达及包涵体的变性和复性处理 ,获得可溶性p5 0和p65 ,同时用Western Blot鉴定NF κBp5 0和p65蛋白的表达 ,EMSA实验检测NF κBp5 0和p65蛋白的DNA结合活性。结果 构建了pET 2 2b/p5 0和pET 2 2b/p65原核表达质粒 ;p5 0、p65蛋白在大肠杆菌中的表达均为包涵体 ;变性、复性后得到了可溶性p5 0和p65蛋白 ,浓度达 2 18μg/ml和 15 8μg/ml;并证实可溶性p5 0和p65蛋白均具有DNA结合活性。 结论 成功建立了pET 2 2b/p5 0和pET 2 2b/p65原核表达系统 ,获得了具有DNA结合活性的NF κBp5

P65基因对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231体外侵袭的影响

目的:观察miRNA靶向沉默P65基因对人三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)MDA-MB-231细胞体外黏附和侵袭的影响及其可能机制。方法:设计3对针对P65基因的特异性miRNA(P65miRNA-1、P65miRNA-2和P65miRNA-3),转染MDA-MB-231细胞,Western blotting检测P65蛋白的表达,筛选沉默效果最好的miRNA进行后续实验。体外黏附实验和Transwell小室实验检测P65miRNA转染前后MDA-MB-231细胞的黏附和侵袭。RT-PCR检测MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9 mRNA的表达水平,明胶酶谱法检测MDA-MB-231细胞中MMP-2、MMP-9的酶活性。结果:成功构建重组质粒P65miRNA-1、P65miRNA-2和P65miRNA-3,前两者转染MDA-MB-231细胞后抑制P65蛋白表达80%以上。P65miRNA-1和P65miRNA-2转染对MDA-MB-231细胞的黏附无明显影响(P>0.05),但显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭(0.371±0.039、0.309±0.046 vs 0.698±0.065,P<0.05)。P65miRNA-1和P65miRNA-2转染沉默P65表达后,MDA-MB-231细胞MMP-2 mRNA(0.281±0.018、0.478±0.023 vs 1.056±0.072、1.128±0.059,P<0.05)和MMP-9 mRNA表达(0.193±0.013、0.371±0.035 vs 1.206±0.069、1.089±0.057,P<0.05)及其活性均显著下调。结论:miRNA靶向沉默P65的表达能抑制人TNBC MDA-MB-231细胞的体外侵袭,其机制可能与抑制MMP-2、MMP-9的表达和活性有关。

反义NF-κB p65寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响

目的:探讨反义NF-κBp65寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法:利用转染试剂KeyGenI介导将反义NF-κBp65寡核苷酸片段体外转染入人食管鳞癌EC9706细胞株。转染72h后,应用RT-PCR、流式细胞术检测EC9706细胞中NF-κBp65mRNA和蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞增殖周期。以单纯转染试剂为阴性对照,未转染的EC9706细胞为空白对照。结果:转染72h后,反义组EC9706细胞中NF-κBp65mRNA的表达及蛋白标记率与阴性对照和空白对照组比较,下降明显,差异具有统计学意义(P<0.05);反义组EC9706细胞的增殖能力与阴性对照和空白对照组相比明显受抑,抑制率为15.0%;反义组EC9706凋亡细胞数较阴性对照、空白对照组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);反义组G1期的EC9706细胞数较阴性对照、空白对照组升高,而S期细胞数较阴性对照、空白对照组降低,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论:特异性阻断NF-κBp65的转录,可以抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,参与细胞周期调控。NF-κBp65有望成为肿瘤基因治疗的靶点。

沉默NF-κB/p65对TNF-α诱导的肺泡Ⅱ型上皮NOX1基因表达的影响

目的构建急性肺损伤肺泡Ⅱ型上皮A549细胞炎症模型,通过沉默NF-κB基因,观察NOX1基因表达水平及氧化应激指标变化,探讨NOX1基因与NF-κB/p65的相关性。方法运用RNA干扰技术沉默NF-κB/p65基因,以TNF-α(10 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549),采用RT-PCR及Western blot检测NOX1基因表达水平,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧水平,比色法检测细胞的总抗氧化能力、总谷胱甘肽、总超氧化物歧化酶活力和丙二醛的浓度。结果采用TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮A549细胞可以分别在基因和蛋白水平上调NOX1基因表达;同时,增加细胞丙二醛和活性氧浓度,降低总抗氧化能力、总谷胱甘肽及超氧化物歧化酶浓度,氧化应激程度放大(P<0.05)。预转染NF-κB/p65 siRNA,可下调NOX1基因的表达,减少细胞丙二醛、活性氧生成,提高总抗氧化能力、总谷胱甘肽及超氧化物歧化酶浓度,氧化应激程度降低(P<0.05)。结论沉默NF-κB/p65基因,可有效下调TNF-α诱导A549细胞氧化应激程度及NOX1基因表达水平,提示NF-κB/p65可能参与调控TNF-α诱导的NOX1基因表达。

利用RNA干扰抑制人肝癌细胞中核因子-κB p65基因的表达

目的:用小干扰RNA(siRNA)抑制核因子-κB(NF-κB)p65基因在人肝细胞癌细胞中的表达。方法:从p65的cDNA序列中挑选3个RNA干扰靶位点,用体外转录法制备siRNA,以萤光素酶基因的siRNA为对照,分别转染Hep3B和SMMC-7721细胞,用逆转录半定量PCR和免疫印迹检测siRNA对p65基因表达的抑制效率。结果:3条siRNA对p65基因的表达都有抑制作用,其中2条siRNA的抑制作用更为显著,最高抑制效率约为70%。结论:制备的p65-siRNA可用于研究NF-κB在肝细胞癌发生发展中的作用。

靶向沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响

目的利用miRNA靶向沉默p65基因,观察其对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响。方法以脂质体LipofectamineTM2000为载体,将针对特异靶点p65基因的miRNA转染入MDA-MB-231细胞。RT-PCR和Western blot法检测p65 mRNA和蛋白表达的变化;MTT法检测细胞增殖;流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡;Western blot法检测凋亡相关因子表达的变化。结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示,p65miRNA转染组p65 mRNA及蛋白表达量较对照组显著下降(P<0.05);MTT检测结果显示,沉默p65基因后,细胞出现了生长抑制现象;FCM检测结果发现,p65miRNA转染组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。Western blot进一步检测发现,转染组细胞中caspase-3的前体蛋白条带变细,裂解片段条带加深;PARP蛋白出现裂解片段。结论 miRNA靶向沉默p65基因可抑制人乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,推测p65基因可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。

AEG-1和NF-kB p65在人肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的：探讨人肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中星形细胞上调基因-1（astrocyte elevated gene-1,AEG-1）、核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）p65的表达及临床意义.方法：采用免疫组织化学SP法检测AEG-1和NF-κB p65蛋白在40例HCC组织、对应癌旁肝组织及8例正常肝组织中的表达情况.用Western blot方法检测肝癌及癌旁肝组织、正常肝组织中AEG-1和NF-κB p65的表达水平.应用Kaplan-Meier法分析AEG-1和NF-κB p65的表达与肝癌患者预后的关系.结果：HCC组织、癌旁肝组织、正常肝组织中的AEG-1阳性表达率分别是72.5%（29/40）、60%（24/40）、12.5%（1/8）,三者之间的差异具有统计学意义（χ^2=9.74,P〈0.05）.且AEG-1在HCC组织、癌旁组织中的表达明显高于在正常肝组织中的表达（P〈0.05）.NF-κB p65在HCC组织、癌旁组织、正常肝组织中的阳性表达率分别是75%（30/40）、62.5%（25/40）、12.5%（1/8）,三者之间的差异具有统计学意义（χ^2=11.29,P〈0.05）,且NF-κB p65在HCC组织、癌旁组织中的表达明显高于在正常肝组织中的表达（P〈0.05）.Western blot结果与免疫组织化学结果一致.AEG-1、NF-κB p65双阳性组的生存率低于单阳性组,差异有显著性（P〈0.05）.结论：AEG-1可能通过上调NF-κB p65的表达而促进HCC的发生和转移,联合检测AEG-1及NF-κB p65在人肝细胞癌中的表达,有望成为肝癌分子靶向治疗及预后评价的重要指标.

NF-κB p65基因沉默条件下HT29细胞中Survivin表达活性的研究

目的:以特异性siRNA转染结肠癌细胞HT29,沉默NF-κB p65基因的表达,研究肿瘤细胞中NF-κB p65调节Survivin基因的表达。方法:以噻唑蓝(MTT)法观察对细胞增殖活性的影响,明确最佳的作用浓度。通过Western Blot检测结肠癌细胞内NF-κB p65及Survivin蛋白表达水平的变化。将设计合成好的特异性针对NF-κB p65基因的片段,体外转染结肠癌细胞株HT29,Western Blot检测NF-κB p65基因沉默效应,进而观察对结肠癌细胞内Survivin蛋白表达水平的影响,明确NF-κB p65是否有Survivin表达的调节作用。结果:siRNA干扰后细胞内NF-κB p65蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义(P<0.01)。同时NF-κB p65基因沉默后,取消了先前缺氧条件下细胞内Survivin的表达增高,与对照细胞组相比无统计学意义差异(P>0.05)。结论:采用特异性siRNA片段对结肠癌进行靶向NF-κB p65基因沉默,能有效降低Survivin基因的表达,抑制Survivin可能通过多种信号转导通路参与肿瘤的发生发展过程。

雷帕霉素干预急性肺损伤SD大鼠NF-κB p65和STAT-1基因表达研究

目的研究雷帕霉素对输血相关急性肺损伤(TRALI)和急性胰腺炎相关性肺损伤(APALI)的SD大鼠肺组织核转录因子p65(NF-κB p65)和信号转导与转录激活子-1(STAT-1)基因相对表达量的影响。方法将SD大鼠60只随机分成6组,分别为TRALI组、APALI组、雷帕霉素干预TRALI组、雷帕霉素干预APALI组、雷帕霉素干预对照组、正常对照组,每组10只。应用实时荧光定量RT-PCR检测大鼠肺组织NF-κB p65和STAT-1基因相对表达量,分析雷帕霉素对TRALI、APALI在mTOR相关细胞凋亡过程的干预作用。结果相比正常对照组,TRALI及APALI组大鼠肺组织NF-κB p65和STAT-1基因相对表达量均有不同程度下降(P<0.05),且APALI组下降程度比TRALI组更明显(P<0.01);雷帕霉素干预后,TRALI组NF-κB p65和STAT-1基因相对表达量与TRALI组比较均进一步下降(P<0.01),而APALI组和对照组下降则不明显或无变化(P>0.05)。结论应用雷帕霉素干预治疗TRALI大鼠可能会进一步加重其肺损伤的程度,而雷帕霉素对APAL大鼠则影响作用有限。

受体酪氨酸激酶Mer对高糖环境培养的大鼠雪旺细胞系RSC96增殖调控作用观察

目的观察受体酪氨酸激酶Mer(MER tyrosine kinase,Mertk)在高糖环境培养条件下的大鼠雪旺细胞系RSC96增殖的调控作用。方法取RSC96分为一、二、三、四、五组,分别置于含25(正常葡萄糖浓度)、50、75、100及125 mmol/L葡萄糖的培养基中培养,培养48 h时采用Western Blotting法检测各组细胞Mertk,筛选Mertk蛋白相对表达量最高浓度为后续研究的高糖浓度。取RSC96细胞先饥饿处理4 h,置入含100 mmol/L的葡萄糖培养基中,分别于培养0、24、36、48、60 h时取各组细胞,采用Western Blotting法检测各组细胞Mertk,最终筛选Mertk蛋白相对表达量高的时间为后续研究培养时间。取RSC96细胞,分为对照组、高糖组、高糖敲降组及敲降组:高糖组细胞饥饿处理4 h,置于含100 mmol/L葡萄糖的培养基中培养;高糖敲降组细胞饥饿处理4 h,置于含100 mmol/L葡萄糖的培养基中,后加入5μL的敲降Mertk基因表达siRNA溶液;敲降组细胞饥饿处理4 h,加入5μL的敲降Mertk基因表达siRNA溶液;对照组细胞用正常培养基培养。培养48 h时取各组细胞,采用Edu法测算各组细胞增殖活力,采用Western Blotting法检测各组细胞Mertk、磷酸化核转录因子κB、P65及肿瘤坏死因子α(TNF-α)。结果与一组相比,四、五组细胞Mertk蛋白相对表达量高(P均<0.05);与培养0 h相比,培养48、60 h时RSC96细胞Mertk相对表达量高(P均<0.05)。与对照组相比,高糖组细胞增殖活力低(P<0.05),敲降组细胞增殖活力高(P<0.05);与对照组相比,高糖敲降组细胞P65、TNF-α相对表达量高(P均<0.05),敲降组细胞Mertk相对表达量低、P65及TNF-α相对表达量高(P均<0.05),高糖组细胞Mertk、P65及TNF-α相对表达量高(P均<0.05)。结论敲降Mertk基因表达的高糖环境培养RSC96细胞的增殖能力高,细胞P65、TNF-α表达高。Mertk可能通过促进细胞P65、TNF-α表达,促进高糖环境培养RSC96细胞的增殖。

白血病耐药细胞中多药耐药基因MDR1与核转录因子κB的关系

目的:研究核转录因子κB与多药耐药基因MDR1在白血病化疗耐药中的作用,阐明核转录因子κB(NF-κB)与白血病多药耐药的关系及相关分子机制。方法:白血病细胞K562和阿霉素(ADM)诱导的耐药细胞K562/ADM分别应用ADM(0、0.25、0.50、1.00和2.00μg.L-1)或丝裂霉素(MIT)(0、2、4、8和16 mg.L-1)作用48 h,通过MTT法检测细胞生存率,计算细胞耐药指数;RT-PCR方法检测MDR1和IκBmRNA表达;Western blotting方法检测P-gp和P65的蛋白表达。结果:ADM和MIT分别作用后,与空白对照组比较,白血病细胞K562细胞生存率下降(P<0.01),呈剂量依赖性;ADM和MIT对耐药细胞K562/ADM生存率作用不明显;在mRNA水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的MDR1 mRNA高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00μg.L-1或MIT 4和8 mg.L-1分别作用K562细胞和K562/ADM细胞,IκBαmRNA表达均下降(P<0.01),并呈剂量依赖性;在蛋白水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的P-gp蛋白高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00μg.L-1或MIT 4和8 mg.L-1分别作用K562/ADM细胞,P-gp蛋白表达量升高(P<0.01),同时P65蛋白表达量升高,且呈药物剂量依赖性(P<0.01)。结论:MDR1基因及P-gp蛋白的高表达很可能是白血病细胞K562多药耐药性形成的关键机制,而NF-κB的激活可能参与了多药耐药的调控。

CBP基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的影响

目的观察小干扰RNA(siRNA)重组慢病毒介导的CREB结合蛋白(CBP)基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响,并探讨其作用机制。方法雄性SD大鼠48只,随机分为4组:假手术组、PBS对照组、慢病毒介导CBP基因siRNA转染组(CBP-siRNA-Lenti组)及慢病毒介导非CBP同源序列siRNA转染组(NC-siRNA-Lenti组),建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,术后28天处死动物。分别用实时定量PCR、Western Blot检测大鼠颈动脉CBP和乙酰化核因子κB p65(NF-κB p65)的表达水平;病理组织学观察血管内膜增生情况;免疫组织化学染色对损伤血管壁增殖细胞核抗原(PCNA)的表达进行评估。结果术后28天,与PBS对照组和NC-siRNA-Lenti组比较,CBP-siRNA-Lenti组CBP mRNA和蛋白的表达显著下调(P均<0.05),CBP沉默能明显抑制新生内膜面积(0.108±0.008 mm2比0.238±0.022 mm2、0.252±0.016 mm2,P<0.05)、内膜与中膜面积比(0.706±0.062比1.483±0.136、1.497±0.137,P<0.05)的增加,及下调血管壁乙酰化NF-κB p65和PCNA的表达水平(P均<0.05)。结论慢病毒介导的CBP基因沉默能有效地抑制颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成,其机制可能与抑制NF-κB p65的过度乙酰化有关。

FRNK抑制人乳腺癌细胞体外增殖及机制研究

目的:研究黏着斑相关非激酶(focal adhesion kinase related non-kinase,FRNK)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用及相关机制。方法:通过RT-PCR方法克隆目的基因FRNK,构建pcDNA3.1-FRNK重组质粒;经脂质体分别介导重组质粒(pcDNA3.1-FRNK)、阳性对照质粒(pcDNA3.1-GFP)和空质粒(pcDNA3.1)转染MCF-7细胞,以正常MCF-7细胞作为空白对照;通过检测转染后细胞FRNK蛋白的表达,并结合转染pcDNA3.1-GFP后细胞表达荧光的多寡来评估转染效率;采用MTT法研究转染后12、24、48和72h各时间点细胞的增殖情况;转染质粒48h后,采用流式细胞术分析MCF-7细胞周期,Westernblot法检测细胞核内NF-κBp65的表达。结果:pcDNA3.1-FRNK质粒可经脂质体介导高效转染MCF-7细胞,促进细胞FRNK的表达,FRNK表达量在转染后48h达高峰;转染pcDNA3.1-FRNK后,MCF-7细胞增殖趋缓,且这种抑制增殖呈一定的时间依赖性;转染FRNK基因后,S+G2/M期的细胞比例较正常细胞显著下降(P<0.05);转染pcDNA3.1-FRNK后MCF-7细胞核内NF-κBp65蛋白表达减少。结论:FRNK可抑制MCF-7细胞增殖,其抑制作用与下调NF-κBp65核易位相关。

核因子κB p65及靶基因在CagAHp胃癌及癌前病变中的表达研究

目的 检测核因子κappaBp6 5 (NFκBp6 5 )及靶基因在幽门螺杆菌 (Hp)感染的肠上皮化生 (IM)、不典型增生 (Dys)、胃癌 (GC)组织中的表达 ,探讨表达细胞毒素相关抗原A的幽门螺杆菌(CagA+ Hp)致胃癌的分子生物学机制。方法 采用ELISA方法检测患者血液中的CagA抗体 ;以快速尿素酶试验和Warthinstarry法检测组织中的Hp ;以免疫组织化学方法检测 12 2例肠上皮化生、10 4例不典型增生及 6 3例胃癌组织中的NFκBp6 5及其靶基因c myc、CyclinD1和bcl xl的表达。结果 IMⅠ和IMⅡ、IMⅢ、DysⅠ、DysⅡ和DysⅢ以及GC组织中 ,NFκBp6 5阳性表达率在CagA阳性组较CagA阴性组高 ,差异有显著性。IMⅢ、DysⅡ和DysⅢ组织中 ,c myc、CyclinD1和bcl xl在CagA阳性组表达率较CagA阴性组高 ,差异有显著性。NFκBp6 5在IMⅢ、DysⅡ和DysⅢ组织中 ,阳性表达率与靶基因阳性表达相一致。CagA+ Hp感染的胃癌组织中 ,NFκBp6 5、c myc、CyclinD1和bcl xl阳性表达率在肠型胃癌中高于弥漫型胃癌 ,差异有显著性。结论 弥漫型胃癌与肠型胃癌的发生机制不同。CagA+ Hp感染与肠型胃癌发生有关 ;CagA+ Hp感染后 ,NFκBp6 5上调c myc、CyclinD1和bcl xl在肠上皮化生及不典型增生组织中的表达 ,促进肠型胃癌发生。通过抑制NFκBp6 5的活?

猪肺炎支原体168弱毒菌株P65-DnaKc融合蛋白的表达及免疫原性

研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株融合蛋白P65-DnaKc免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株p65和dnaKc基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28α-P65,pET-28α-DnaKc以及pET-28α-P65-DnaKc,经原核表达并纯化获得的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验,记录分析试验结果。经间接ELISA试验证明单蛋白P65、DnaKc以及融合蛋白P65-DnaKc均具有良好的免疫原性,血清效价分别为:1∶12 800、1∶51 200和1∶204 800,融合蛋白的血清抗体效价明显高于单蛋白;攻毒试验证明,P65-DnaKc重组蛋白疫苗的保护率可达90%。融合蛋白P65-DnaKc具有良好的优于P65和DnaKc单蛋白的免疫原性。

NF—κB／P65、FHIT在结直肠癌的表达及临床病理意义

目的研究生物标志物NF—κB／P65及FHIT在结直肠癌的表达及肿瘤生物学特点，探讨其与患者无瘤生存时间和总体生存时间的关系。方法采用PV6000二步法检测359例结直肠癌（其中198例有完整的随访资料）及35例癌旁正常组织NF-κB／P65及FHIT表达的异同。结果结直肠癌NF-κB／P65的阳性率为67．7％（243／359），FHIT的阳性率为46．0％（165／359）。NF-κB／P65和FHIT均与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及远处转移相关（P均〈0．05）。FHIT还与肿瘤的肠壁浸润深度及组织学分级呈负相关（r值分别为-0．29和-0．25，均P〈0．05）。NF-κB／P65阳性表达组患者的5年生存率显著低于阴性组，而FHIT阳性组患者的5年生存率则显著高于阴性组（x^2值分别为23．25和51．13，均P〈0．05）。NF—κB／P65与FHIT在结直肠癌的表达呈负相关（r=-0．167，P=0．019）。NF—κB／P65在结直肠癌组织中的表达明显高于在癌旁正常组织中的表达，而FHIT在结直肠癌组织中的表达则明显低于在癌旁正常组织中的表达（x^2值分别为40．78和15．93，均P〈0．05）。COX多因素分析的结果显示，NF-κB／P65是患者无瘤生存时间及总体生存时间的独立预后因子。结论NF—κB／P65及FHIT在结直肠癌的发生、发展及转移中发挥重要作用，可以作为结直肠癌临床评价肿瘤生物学行为及判断预后的有效指标。

bcl-2与NF—κB／p65在弥漫性大B细胞淋巴瘤不同亚型中表达的意义

目的探讨bcl-2与NF—κB／p65蛋白在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）不同亚型中的表达及其意义。方法用免疫组织化学方法检测DLBCL患者CD10、bcl-6、MUM-1蛋白的表达，以Hans等的分型原则将其划分为GCB和非GCB／ABC亚型，同时标记bcl-2与NF—κB／p65抗体，比较bcl-2与NF—κB／p65蛋白在GCB和ABC亚型中的表达情况并分析二者与DLBCL两种主要亚型生存率的相关性。结果bcl-2与NF—κB／p65蛋白在DLBCL中的表达率为67．1％和77．1％，二者表达呈正相关；GCB亚型中bcl-2与NF—κB／p65的表达率分别为52．0％和56．0％，ABC亚型中bcl-2与NF—κB／p65蛋白的表达率分别为75．6％和88．9％，ABC亚型中bcl-2与NF—κB／p65的表达率高于GCB亚型；在GCB亚型中，bcl-2与NF—κB／p65蛋白的表达与总生存率无显著的相关性，而在ABC亚型DLBCL中，bcl-2与NF—κB／p65蛋白的表达与生存率密切相关。结论仅在ABC亚型DLBCL中，bcl-2与NF—κB／p65蛋白的表达是影响预后的重要不利因素，因此，需在DLBCL亚分型的基础上评估bcl-2与NF—κB／p65蛋白表达的预后意义。

pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体的构建及蛋白表达

目的克隆NF-κB(p65)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/NF-κB(p65),并进行体外表达研究。方法提取B16总RNA,RT-PCR扩增出NF-κB(p65)基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染到B16细胞中,Real-time PCR和Western-blot检测NF-κB(p65)的抗原性和表达量。结果获得高质量的B16总RNA,RT-PCR扩增出1.65kb的cDNA片段,成功构建了pcDNA3.1/NF-κB(p65)载体,Blast序列分析与GenBank中NM_009045.4完全一致。NF-κB(p65)重组蛋白具有抗原性,其基因和蛋白表达高于B16细胞组和空质粒pcDNA3.1组。结论成功构建pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体和表达出具有NF-κB(p65)抗原性的重组蛋白。

氧化苦参碱对脂多糖诱导的AR42J细胞MyD88/NF-κBp65信号通路的调节作用

【目的】探讨氧化苦参碱(oxymatrine,OM)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的胰腺腺泡细胞(AR42J细胞株)炎症中髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)信号通路所发挥的干预效果,阐明OM治疗胰腺炎的潜在机制。【方法】分别用相应浓度的LPS和/或OM刺激体外培养的AR42J细胞,检测MyD88信号通路相关分子的表达变化。用Western blotting法检测不同浓度的OM作用于AR42J细胞的相关蛋白表达情况,以及LPS不同时间诱导AR42J细胞的相关蛋白的表达情况。用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)mRNA的表达水平。【结果】Western blotting显示LPS作用3 h后能增加AR42J细胞的MyD88/NF-κB p65信号通路的相关蛋白表达,OM浓度为0.5mg/ml时能干预该信号通路的相关蛋白表达。Real-time PCR结果显示OM可明显的降低LPS诱导的AR42J细胞TLR4mRNA的表达量。【结论】对LPS诱导的AR42J细胞的MyD88/核因子-κB p65(NF-κBp65)信号通路的相关蛋白表达的抑制作用可能是OM治疗胰腺炎的机制之一。

乳腺癌组织中BRCA1/2、p65表达与HPV感染的相关性

目的探究乳腺癌组织中乳腺癌易感基因1/2(BRCA1/2)、核因子κB亚基p65表达与人乳头状瘤病毒(HPV)感染的相关性。方法选取2019年1月-2020年10月杭州市萧山区第一人民医院收治的乳腺癌患者184例为研究组,乳腺良性肿瘤患者60例为对照组,检测两组患者乳腺肿瘤组织HPV、BRCA1/2、p65表达情况,分析HPV、BRCA1/2、p65阳性表达与乳腺癌临床病理特征的关系。结果研究组HPV、p65表达阳性率高于对照组,BRCA1、BRCA2表达阳性率低于对照组(P<0.05);乳腺癌淋巴结转移患者HPV阳性率高于淋巴结未转移患者(P<0.05);乳腺癌不同临床分期、淋巴结是否转移BRCA1、BRCA2、p65阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05);HPV阳性乳腺癌患者BRCA1、BRCA2阳性率低于HPV阴性患者(P<0.05),p65阳性率高于阴性患者(P<0.05)。结论乳腺癌患者HPV、p65阳性率上调,BRCA1/2阳性率下调,且相互作用参与乳腺癌的发病与进展。