P66Shc分子在肿瘤发生发展中的作用及机制研究进展

P66Shc作为ShcA家族成员,具有家族特有的高度保守结构域,对细胞的增殖、分化和凋亡起重要的调控作用,因而在肿瘤发生发展中也起着关键性作用。在不同的肿瘤细胞中,p66Shc的表达表现出两面性:既可促进肿瘤生长和转移,也可以抑制肿瘤发展。异常水平表达的p66Shc通常与肿瘤细胞过度增殖、高转移风险和不良预后相关。P66Shc还可通过激活氧化应激通路来调节肿瘤细胞的代谢状态,参与协调肿瘤细胞凋亡、自噬和失巢凋亡等不同死亡方式。探究p66Shc在肿瘤发生发展中的作用及机制,可为肿瘤临床治疗中有效靶点的寻找带来更多新的突破。

衔接蛋白p66Shc在心肌缺血再灌注损伤中的作用研究进展

缺血性心脏病是全世界死亡率较高的疾病之一,长期危害着人类的健康,其首选治疗策略再灌注可导致心肌缺血恶化及加速损伤,即心肌缺血再灌注损伤(MIRI),严重影响临床疗效及患者预后。目前MIRI的预防和治疗仍是临床尚未解决的难题。大量研究表明,衔接蛋白p66Shc在包括MIRI对内的多种疾病的发生发展具有重要的调控作用。本文针对衔接蛋白p66Shc在MIRI氧化应激、炎症反应和血管内皮功能障碍中的调节作用机制,以及以p66Shc为靶点的相关治疗策略进行综述,以期为MIRI的预防和治疗提供进一步的参考。

慢肾康宁方对慢性肾衰大鼠肾组织氧化应激状态及Caspase-3,JNK,p66Shc蛋白表达影响

目的:观察中药慢肾康宁方对腺嘌呤诱发的慢性肾衰大鼠肾脏氧化应激状态及p66Shc,Caspase-3和JNK蛋白的影响。方法:60只wistar大鼠随机分成正常组,模型组,氯沙坦组,中药慢肾康宁方低、中、高质量分数组,除正常组给予生理盐水灌胃外,其余各组使用腺嘌呤灌胃复制慢性肾衰大鼠模型,时间是21d。检测模型建立成功后,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,其余各组对应给予等量药物进行治疗,疗程为28d。实验结束后,检测各组大鼠血清尿肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)的含量,采用化学比色法测定肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量,提取肾组织蛋白,通过Western blotting进行p66Shc,Caspase-3和JNK蛋白的检测。结果:造模成功后,模型组Scr及BUN水平明显升高,显著高于正常组(P<0.01),SOD水平降低,MDA活性升高,与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.05),肾脏组织内Caspase-3,JNK,p66Shc及其磷酸化位点p66Shc-ser36表达量明显上升(P<0.05)。经药物治疗后,中药低中高剂量组及氯沙坦组Scr和BUN均明显降低(P<0.01),SOD活性升高,中药高剂量组和氯沙坦组升高明显(P<0.05),其余治疗组具有升高趋势,MDA含量明显降低,氯沙坦组和中药高剂量降低趋势明显(P<0.05),其余各组存在降低趋势,Caspase-3,JNK,p66Shc及磷酸化蛋白p66Shc-ser36表达量较模型组相比均呈现出下降趋势(P<0.05)。结论:中药慢肾康宁方高剂量治疗组能够降低慢性肾衰大鼠血清Scr,BUN水平,改善肾间质纤维化程度,作用的机制可能与提高SOD水平,降低MDA表达,改善肾脏氧化应激状态及降低Caspase-3,p66Shc和JNK蛋白表达水平相关。

结肠癌中雌激素受体和衔接蛋白p66Shc的表达和意义

背景:雌激素和雌激素受体(ER)在结肠癌的发生、发展中起重要作用,然而ER在其中的具体作用机制尚不完全清楚。在甾类激素敏感性肿瘤细胞中,甾类激素可显著上调衔接蛋白p66Shc表达并刺激细胞增殖。目的:探讨ER和p66Shc在结肠癌中的表达特点及其临床意义。方法:以免疫组化方法检测65例石蜡包埋结肠癌组织及其癌旁非癌组织中的ER和p66Shc蛋白表达,分析p66Shc蛋白表达与结肠癌临床病理特征的相关性。结果:ER和p66Shc蛋白表达分别定位于细胞核和细胞质,结肠癌组织中的ER和p66Shc蛋白表达阳性率显著高于癌旁非癌组织(ER:47.7%对0%,P<0.01;p66Shc:49.2%对0%,P<0.01),且两者呈正相关(r=0.43,P<0.05)。p66Shc蛋白表达与结肠癌患者的性别、年龄以及原发肿瘤部位、肿瘤大小、大体类型、浸润深度、淋巴结转移、AJCC分期均无相关性,而与肿瘤组织学分级相关(高分化:22.2%,中分化:47.7%,低分化:75.0%,P=0.046)。结论:结肠癌可能是一种雌激素敏感性肿瘤。雌激素及其受体可能与p66Shc共同参与了结肠癌的发生、发展。

急性心肌梗死患者外周血单个核细胞P66Shc mRNA的表达及其与氧化应激的关系

目的探讨急性心肌梗死患者外周血单个核细胞P66Shc mRNA的表达及其与氧化应激的关系。方法选择经冠状动脉造影检查及治疗的患者67例,根据临床表现和冠状动脉造影结果分成健康对照组23例,稳定型心绞痛组23例,急性心肌梗死组21例。通过检测血中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平,对机体氧化应激状态进行全面分析,在此基础上运用RT-qPCR比较三组外周血单个核细胞中P66Shc mRNA的表达,并对P66Shc mRNA的表达与MDA及SOD进行相关性分析。结果急性心肌梗死组MDA明显高于稳定型心绞痛组和健康对照组(P<0.05),而SOD明显低于稳定型心绞痛组和健康对照组(P<0.01);急性心肌梗死组P66Shc mRNA的表达明显高于稳定型心绞痛组及健康对照组(P<0.01),而在稳定型心绞痛组与健康对照组之间无明显差别(P>0.05),且P66Shc mRNA的表达量与MDA水平呈正相关(r=0.49,P=0.024),与SOD水平相关性不明显。结论急性心肌梗死时P66Shc mRNA表达增高,P66Shc可能介导了斑块由稳定到不稳定性转化的机制。

p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达及其与胞质氧化还原稳态的关系

[目的]研究p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达特征及其与卵母细胞胞质氧化还原稳态的关系,为揭示p66Shc参与调控卵母细胞胞质氧化还原稳态分子机制提供理论依据。[方法]试验所用卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)来源于屠宰场的绵羊卵巢。分别收集成熟前优质和劣质、常规成熟24 h及成熟30 h老化的卵母细胞,采用实时荧光定量PCR对成熟前后不同质量绵羊卵母细胞中p66Shc mRNA的表达量进行分析,利用细胞免疫荧光结合MitoTracker Red探针对p66Shc蛋白和线粒体进行共定位,同时利用荧光探针DCFH-DA和卵母细胞自发荧光分别对成熟前后不同质量卵母细胞内ROS水平和氧化还原稳态进行检测。此外,采用外源H2O2诱导的氧化应激处理成熟前优质卵母细胞,并对p66Shc蛋白的表达及定位进行了检测分析。[结果]实时荧光定量PCR结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc mRNA表达量分别显著(P<0.05)高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。然而优质卵母细胞成熟前后p66Shc mRNA表达量没有显著差异(P>0.05)。共定位结果表明,p66蛋白主要分布在线粒体分布活跃的区域。细胞免疫荧光结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc蛋白表达量也分别显著(P<0.05)高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。与成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞相比,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞表现出线粒体分布紊乱和活性下降、ROS水平升高以及氧化还原稳态的失衡。此外,与未添加外源H2O2的对照组相比,外源H2O2处理成熟前优质卵母细胞诱导的氧化应激显著(P<0.05)上调p66Shc蛋白的表达并促使p66Shc由胞质向细胞核定位。[结论]p66Shc基因在劣质和老化的绵羊卵母细胞中呈现高水平的表达,H2O2诱导的氧化应激显著上调p66Shc蛋白的表达并影响其亚细胞定位。总之,绵羊卵母细胞中p66Shc表达上调影响了胞质的氧化还原稳态。

慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默

目的构建p66shc基因重组慢病毒表达载体,并将之转染至293T细胞,通过RNA干扰致使p66shc基因沉默,为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点,命名为p66shc-shc1、p66shc-shc2、p66shc-shc3,与双酶切后的pLenR-绿色荧光蛋白(GPH)(含有GFP表达)连接,转化入感受态的DH5α细胞,挑取阳性克隆测序正确后,与pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G一起转染293T细胞,于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达,证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Western blot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达,选取有效沉默p66shc基因的p66shc-shc1靶点,为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内,通过荧光定量PCR及Western blot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体,转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。

衔接蛋白p66Shc在糖尿病及其并发症中的作用

p66Shc是调控氧化应激和生命周期的关键蛋白。在氧化应激信号的刺激下,p66Shc在线粒体内氧化细胞色素C产生大量活性氧,造成细胞的氧化损伤。最新的研究表明,p66Shc可能在衰老及衰老相关的疾病如糖尿病中扮演关键的角色。本文简要综述p66Shc的结构、功能、相关的信号通路及其在糖尿病领域的最新研究进展。

膀胱癌中衔接蛋白p66Shc的表达及临床意义

目的观察p66Shc蛋白在膀胱癌中的表达,分析其表达与膀胱癌临床分期、病理类型、转移等的关系,以及p66Shc影响膀胱癌细胞增殖、凋亡的分子机制。方法 应用免疫组化法和Western blot技术检测32例膀胱癌中p66Shc蛋白的表达,分析p66Shc蛋白表达和临床病理特征的关系。Western blot技术检测T24细胞中PKCβ和p66Shc蛋白及其磷酸化水平,以及p53、Bax和BCL-2蛋白水平。结果 膀胱癌组织中p66Shc阳性率为65.6%(21/32),其在T3+T4期膀胱癌中的表达显著高于T1+T2期膀胱癌( P <0.05);p66Shc表达与患者年龄、性别、分化程度无关( P >0.05)。LY333531下调T24细胞中PKCβ和p66Shc蛋白及其磷酸化水平,以及下调p53、Bax和上调BCL-2的蛋白水平。结论 p66Shc蛋白在膀胱癌中的表达与膀胱癌临床分期相关,随着pTNM分期增加而表达增多。p66Shc磷酸化促进肿瘤细胞的增殖和凋亡。

siRNA干扰技术沉默p66SHC对结直肠癌细胞生物学特性的影响

目的探讨干扰p66shc基因表达对结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移、迁移的影响。方法实验分为对照组(不做任何处理)、NC-siRNA组和p66SHC-siRNA组,NC-siRNA组、p66SHC-siRNA组通过Lipofectamine 2000将特异性siRNA转染入结直肠癌HCT116细胞中。荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞中p66SHC的表达量;四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞的增殖能力;划痕实验和Transwell法观察细胞迁移、侵袭的变化;Western Blot检测细胞EMT相关蛋白钙黏蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、钙黏蛋白N(N-cadherin)的水平。结果采用siRNA干扰HCT116细胞中p66SHC蛋白的表达后,细胞的增殖能力显著下降(P<0.05),明显抑制细胞侵袭、迁移能力(P<0.05),E-cadherin蛋白的水平明显上调(P<0.05),Vimentin、N-cadherin蛋白的表达水平显著下调(P<0.05)。结论干扰p66SHC基因的表达能阻碍EMT的发生,从而降低结直肠癌细胞的增殖、侵袭以及迁移能力。

p66shc基因表达与老年糖尿病患者早期肾损伤的相关性

目的研究p66shc基因在老年糖尿病患者外周血单核细胞中的表达及其与早期肾损伤指标的关系。方法采用实时PCR技术检测74例老年糖尿病患者和48例健康老年人(对照组)外周血单核细胞中p66shc基因表达水平,结合临床资料分析p66shc与早期肾损伤指标尿微量白蛋白(m Alb)、转铁蛋白(TRF)、免疫球蛋白(Ig G)、α1-微球蛋白(α1-MG)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)之间的相关性。结果 p66shc基因在老年糖尿病患者中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,老年糖尿病患者m Alb、TRF、Ig G、α1-MG、NAG均显著升高(均P<0.01),并均与p66shc基因的表达水平呈正相关。结论 p66shc与老年糖尿病患者早期肾损伤密切相关,可为老年糖尿病患者肾损伤的早期诊断提供新的依据。

SIRT1/p66Shc介导小檗碱对阿霉素诱导心肌毒性拮抗作用研究

【目的】基于细胞水平观察小檗碱对阿霉素诱导心肌细胞沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)/p66Shc通路的影响,探讨小檗碱抗阿霉素所致心肌毒性作用的机制。【方法】应用阿霉素(1μmol/L)处理人心肌细胞系AC16建立阿霉素心肌毒性模型。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞存活率,二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色荧光显微镜照像测定细胞活性氧簇(ROS)水平,罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像测定线粒体膜电位(MMP),荧光染料Rhod2-AM(分子探针)测定线粒体Ca^(2+)浓度([Ca^(2+)]m),蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定细胞SIRT1、p66Shc及凋亡蛋白Bax的表达水平。【结果】用1μmol/L小檗碱预处理可明显抑制1μmol/L阿霉素引起的AC16心肌细胞毒性作用,使细胞存活率升高,表现为抑制阿霉素引起的细胞内ROS生成增多、抑制阿霉素致细胞凋亡(使凋亡蛋白Bax表达下调)和减轻线粒体损伤。阿霉素处理的AC16心肌细胞中p66Shc表达增强且SIRT1蛋白表达下降;预先加用小檗碱组中,阿霉素上调p66Shc及下调SIRT1表达的效应显著减弱;而1μmol/L EX527(SIRT1抑制剂)预处理则加重阿霉素引起的AC16细胞损伤,这种细胞损伤未能被小檗碱预处理所改善。【结论】小檗碱可通过SIRT1介导的p66Shc抑制保护AC16心肌细胞对抗阿霉素诱导的心肌毒性。

P66shc基因多态性及单体型与和田维吾尔族长寿人群肾功能衰退的关系研究

目的探讨P66shc基因rs8191981、rs4845401位点多态性与和田维吾尔族长寿人群肾功能衰退的关系。方法采用多重SNaPshot方法对在65例肾功能减退(病例组)和47例肾功能正常者(对照组)的P66shc基因rs8191981、rs4845401位点多态进行基因分型。结果病例组和对照组P66shc基因rs8191981、rs4845401位点的基因型频率、等位基因频率及单体型分布差异均无统计学意义(P>0.05);与长寿老人肾功能减退的关联分析显示:P66shc基因所测位点多态性与维吾尔族长寿老人肾功能减退不相关(P>0.05)。结论 P66shc基因rs8191981、rs4845401位点多态可能与新疆维吾尔族长寿人群肾功能减退无关。

衰老蛋白p66Shc在糖尿病发生中的作用

p66Shc是一种重要的衰老蛋白,可通过诱导多种类型细胞的凋亡和坏死促使机体老化,它的缺失则增强细胞对活性氧类物质的抗性并延长寿命。最新研究发现p66Shc还与糖尿病并发症的发生存在密切联系,如心脏损伤、内皮细胞功能紊乱等,因此其可望成为糖尿病治疗的新靶点。

重组人p66Shc腺病毒抑制HeLa细胞增殖的机制研究

目的探讨重组人p66Shc腺病毒(AdenoⅩ-p66Shc)对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用及机制。方法MTT法检测细胞活力,DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)生成;ELISA检测8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量;AnnexinⅤ-FITC/PI荧光染色检测细胞凋亡率;Western blot检测相关蛋白表达;免疫共沉淀检测p66Shc与p53之间相互作用。结果重组人p66Shc腺病毒呈剂量依赖性地抑制HeLa细胞增殖(P<0.05),而N-乙酰半胱氨酸能够阻断重组人p66Shc腺病毒的作用。p66Shc能引起细胞ROS水平显著上升(P<0.05),同时伴随8-OHdG含量的升高(P<0.05);p66Shc能引起p53蛋白和CyclinB1蛋白表达及p53磷酸化修饰(p-p53)显著升高(P<0.05),但免疫共沉淀实验结果显示p66Shc与p53并非直接结合,提示p66Shc通过其他信号分子间接调控p53的表达及活性。结论重组人p66Shc腺病毒通过使HeLa细胞ROS水平上升,引起DNA氧化损伤,从而诱导p53表达及其磷酸化修饰升高抑制HeLa细胞增殖。

p66Shc基因表达调控及其在糖尿病肾病研究中的作用

p66Shc是调控细胞氧化应激和生命周期的关键蛋白,在细胞氧化损伤过程中发挥重要作用。糖尿病肾病是引起终末期肾疾病的主要原因,细胞活性氧的过度产生是糖尿病肾病发生和进展的核心环节。本文结合近期p66Shc研究现状和作者以往的研究成果,简要介绍p66Shc基因结构与功能、转录调控、蛋白修饰及线粒体转位及其在与细胞氧化损伤的关系,以及p66Shc基因在糖尿病肾病发病中的作用。

同型半胱氨酸降低衔接蛋白P66Shc DNA甲基化状态引起血管内皮损伤

目的:探讨同型半胱氨酸(Hcy)是否通过降低P66Shc的DNA甲基化状态,引起血管内皮损伤。方法:培养人脐静脉内皮细胞,加入不同浓度Hcy诱导人脐静脉内皮细胞损伤,检测P66Shc、 active-Caspase3的蛋白表达水平并应用甲基化特异性PCR检测P66Shc的DNA甲基化状态改变。另同时加入不同浓度甲基化抑制剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)并检测P66Shc、 active-Caspase3的蛋白表达水平。结果:Hcy诱导人脐静脉内皮细胞中P66Shc和active-Caspase3蛋白表达增加,并可引起P66Shc的DNA低甲基化。加入5-Azacytidine可以下调P66Shc和active-Caspase3蛋白表达。结论:Hcy可以通过降低P66Shc的DNA甲基化状态,引起血管内皮细胞凋亡导致血管内皮损伤。

游泳训练对小鼠心肌PKCδ/P66shc蛋白表达的影响

目的:探究不同强度的游泳训练对小鼠心肌P66shc蛋白的影响。方法:将50只昆明小鼠随机分为对照组(C组)、负重游泳组(E组)、负重游泳+药物组(ER组)、非负重游泳组(P组)、非负重游泳+药物组(PR组),10只/组。C组不运动,E组、ER组、P组、PR组进行4周游泳训练,其中E组、ER组以体重3%负荷进行负重游泳,P组、PR组无负重游泳,60 min/d,每周6次。ER组、PR组小鼠在最后2次运动前腹腔注射PKCδ抑制剂Rottlerin(0.3 mg/kg),C组、E组、P组注射同等剂量生理盐水。在训练结束24 h后取样,Western blot测定小鼠心肌PKCδ、P-PKCδ、P66shc、P-P66shc、NOX2蛋白表达;免疫共沉淀测PKCδ和P66shc;生化分析心肌及血清丙二醛(MDA)、心肌活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)。结果:与C组比较,E组的PKCδ、P-PKCδ、P66shc、P-P66shc、NOX2蛋白表达均明显增加(P<0.01),血清和心肌MDA水平、心肌ROS明显增加(P<0.05或P<0.01),心肌SOD活性降低(P<0.01),P组的PKCδ、P-PKCδ、P-P66shc和NOX2明显增加(P<0.05或P<0.01),心肌SOD活性增强(P<0.05);与E组比较,ER组PKCδ(P<0.01)、P-PKCδ(P<0.01)、P66shc(P<0.05)、P-P66shc(P<0.01)、NOX2(P<0.05)蛋白表达明显减少,P组P66shc蛋白表达显著减少(P<0.05),心肌MDA(P<0.01)和ROS(P<0.05)减少,SOD活性增强(P<0.01);与P组比较,PR组的PKCδ、P-PKCδ、P-P66shc蛋白表达明显减少(P<0.01),NOX2增加(P<0.05)。结论:两种强度的游泳训练均促使小鼠心肌细胞内PKCδ蛋白及其磷酸化增加;高强度游泳训练可显著增强P66shc蛋白表达及磷酸化水平,导致ROS大量生成,抗氧化酶活性下降;低强度游泳训练增强P66shc磷酸化但不促进其蛋白表达,心肌抗氧化能力增强,产生运动适应。

PKCβ/p66Shc介导高尿素引起的人脐静脉内皮细胞ROS的产生

目的探讨PKCβ/p66Shc通路在高浓度尿素引起的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生中的作用。方法体外培养HUVECs,分为正常对照组、甘露醇组、尿素组和尿素+LY333531(PKCβ抑制剂)组。采用CCK8法检测高浓度尿素对细胞活性的影响,倒置显微镜观察细胞形态改变;DCFH-DA法检测细胞内ROS含量;Western blot检测细胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平;免疫荧光技术观察细胞内p-p66Shc水平。结果 25mmol/L尿素明显抑制HUVECs活力,并引起细胞排列紊乱、细胞间隙增大、铺路石样排列结构受到破坏等形态学改变。与对照组相比,25mmol/L尿素引起细胞内ROS水平明显升高,在6h达到峰值;加入PKCβ抑制剂LY333531后ROS水平明显降低。Western blot结果显示,25mmol/L尿素诱导p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平随作用时间的延长而逐渐增加。25mmol/L尿素负荷6h后可见细胞胞质内p-p66Shc免疫反应性明显增强,LY333531可阻断该作用;Western blot检测也显示LY333531可显著抑制高浓度尿素对p-p66Shc水平的上调。结论 PKCβ/p66Shc信号通路是高浓度尿素诱导HUVECs内ROS产生的重要途径。