pBV220载体中外源基因表达水平定量分析

运用基于螺旋区随机堆积的ＲＮＡ二级结构预测与密码子偏性计算等序列分析技术，分析了ｐＢＶ２２０载体中携带的人白细胞介素２、人白细胞介素４等２２个外源基因的表达水平。结果表明：５′端－３０～３９区域和３′端３０～－３９区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义；其次是３′端９ｂｐ的局部密码子偏性，ＳＤ序列与起始密码子ＡＴＧ之间碱基数在８±３范围内与表达水平无显著关系。另外，运用判别分析方法构建了判别函数，判别符合率高达９５．５％。

pBV220载体中外源基因二级结构与表达水平关系

运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了pBV220载体中以表达水平20％作为分类标准的人白细胞介素2、人白细胞介素4等32个外源基因表达水平,结果表明5′端32～41区域和3′端25～46区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义,并运用Bays判别分析方法构建了判别函数,判别符合率为87.5％。

hKGF2在不同原核载体中的构建、表达和纯化分析

目的比较人角质细胞生长因子2(hKGF2)在不同原核表达载体和宿主菌中的表达及相应蛋白纯化及生物学活性。方法RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞提取成熟hKGF2 cDNA,克隆测序后,分别与pBV220和pET-30a(+)表达载体连接,转化不同宿主菌进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot进行蛋白鉴定。针对不同原核表达载体分别用阳离子交换层析和镍亲和层析(Ni-NTA)纯化目的蛋白,电泳分析蛋白纯化结果,并分别检测其生物学活性。结果目的基因片段克隆入pBV220载体后在E.coliJM109中表达量最高,约占菌体总蛋白的15%;克隆入pET-30a(+)载体在E.coliBL21(DE3)中表达量约占菌体总蛋白的25%;均为可溶性表达,不同方法纯化后蛋白纯度达95%以上,均能有效促进人胚胎肾上皮细胞增殖。结论hKGF2基因在不同的宿主菌中蛋白表达不同,以融合蛋白表达纯化效果更好。

人白细胞介素-2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定

根据GenBank报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以本室构建的pPIC9K/IL-2突变体(编码125位半胱氨酸→丙氨酸、18位亮氨酸→蛋氨酸、19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,PCR扩增出突变型人白细胞介素-2基因.用EcoRI和BamHⅠ对目的基因进行双酶切后,插入大肠杆菌表达载体pBV220,转化宿主菌JM109,经菌落PCR筛选阳性重组子、酶切鉴定,DNA序列分析证实,重组质粒pBV220/IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放阅读框.经42℃热诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为15kD的外源蛋白产生,经Western印迹证明为rhIL-2.成功建立了突变型人白细胞介素-2(rhIL-2)基因的大肠杆菌表达系统,为rhIL-2的生产及临床应用奠定基础.

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。

小鼠cAMP应答元件结合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术 ,删除了小鼠CREBcDNA5′端和 3′端非编码序列 ,并引入便于基因操作的酶切位点。经 30次循环的扩增 ,得到改造后的CREBcDNA ,全长 10 71bp。亚克隆后 ,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析 ,测定了DNA序列 ,并以其为插入物 ,构建了 pBV2 2 0 -PCR -CREB重组表达载体。经Western印迹法分析证明 。

IL18-IL2融合基因的克隆及其在大肠埃氏菌(E.coli)中的表达

构建IL-18和IL-2成熟区的融合基因IL18-IL2,并实现其在大肠埃氏菌中的大量表达.抽提经PHA刺激增殖的人淋巴细胞总RNA,RT-PCR法获得IL-18和IL-2基因的成熟区序列,并通过一段Linker相连得到融合基因IL18-IL2;将IL18-IL2克隆至原核表达载体pBV220,并转化至大肠埃氏菌BL21(DE3);阳性克隆经42℃温度诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达情况及正确性.经SDS-PAGE分析,融合基因IL18-IL2在宿主菌中能够表达,其相对表观分子质量约为34.5 kD;Western blot进一步证明重组蛋白正确.实验结果表明,已成功构建了表达人IL18-IL2的菌株,为进一步研究融合蛋白IL18-IL2体内外抗肿瘤活性提供了基础.

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得366bp的核心蛋白基因片段。将其插入连接载体pMD18-T vector中,酶切后再与表达载体pBV220连接,构建重组表达载体pBV220/HCV-C。经鉴定后温度诱导表达,采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测核心蛋白基因的蛋白表达。结果经温度诱导后获得目的基因的非融合表达,SDS-PAGE电泳显示在14000 u处有一表达条带;Western-blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论丙型肝炎病毒核心蛋白基因成功表达,对临床诊断试剂和HCV基因疫苗的研制有一定的意义。

人源S100A1蛋白的表达纯化与鉴定

目的构建pBV220-S100A1表达载体,表达并纯化人源S100A1蛋白,为进一步研究人源S100A1蛋白相关的生物学功能及应用于临床诊断奠定基础。方法采用全基因合成法合成人源S100A1基因;通过GeneBank查询人源S100A1蛋白的氨基酸序列,进行序列优化设计,同时引入EcorI和BamHI酶切位点,构建原核表达载体pBV220-S100A1,热应激诱导其在大肠杆菌(E.coli DH5α)中表达,采用离子交换层析法纯化人源S100A1蛋白,最后采用Transwell迁移实验检测所纯化蛋白的生物活性。结果酶切鉴定和测序分析显示,人源S100A1的基因被成功插入pBV220多克隆位点;S100A1的基因片段在pBV220中的插入位点、碱基序列及读码框和终止子的次序完全正确;S100A1的基因序列位于表达载体pBV220的序列下游。经诱导表达和纯化,最终获得了人源S100A1蛋白,且经迁移实验证明,该纯化蛋白具有较高的生物活性。结论成功建立了人源S100A1蛋白表达载体,表达菌株经诱导表达和纯化,获得了高纯度的蛋白。

金属硫蛋白非融合性原核表达载体的构建

目的:构建表达金属硫蛋白(metallo thionein,MT)的非融合性原核表达载体。方法:以大肠杆菌BL21中的PET-GST-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pBV220载体,转入大肠杆菌DH-5α中。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒PBV220-MT双酶切鉴定与其一致,测序结果正确。结论:成功构建MT原核表达载体,为下一步从DH-5α-pBV220-MT工程菌中表达并纯化非融合性MT打下基础。