LMP-1与LMP-3真核双表达质粒的构建及体外表达

目的:构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,并检测其在体外的表达。方法:采用人工设计合成人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)和LIM矿化蛋白-3(LIM mineralization protein-3,LMP-3)基因片段,分别连接于中介质粒Puc57,经酶切、测序鉴定后,LMP-1和pBudCE4.1先连接,经酶切鉴定,再连接LMP-3,重组双表达质粒行酶切、测序鉴定。用脂质体包裹转染骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染LMP-1基因组(C组)、转染LMP-3基因组(D组)、转染LMP-1和LMP-3双基因组(E组)。采用RT-PCR和Western blot检测LMP-1和LMP-3的表达。结果:酶切及测序证实质粒Puc57-LMP-1、Puc57-LMP-3及其pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核双表达质粒构建成功。该双表达质粒在体外转染骨髓MSCs后可表达LMP-1和LMP-3分子。对RT-PCR及Western blot检测结果行灰度值测量显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.001),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05),C组及D组在LMP-1及LMP-3的表达上的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,证实转染的骨髓MSCs能在体外同时表达LMP-1和-LMP-3分子。

转染p16、p53对白血病细胞株K562及HL-60的抑制作用

本研究构建p53,p16基因真核表达载体,用脂质体法转染入白血病细胞,观察其在白血病细胞中的表达和对白血病细胞的作用。设计并构建包含野生型p53cDNA与p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-53-16,用脂质体法转染白血病细胞,用间接免疫细胞化学法、Western blot法检测鉴定外源性p53及p16的表达情况。通过CCK-8,流式细胞仪检测细胞的生长曲线、细胞周期、细胞凋亡。结果发现:p53p16基因双表达真核载体构建成功,体外转染入白血病细胞后能检测到外源性P53、P16蛋白在白血病细胞中表达。转染48小时后,试验组与对照组比较,细胞周期阻滞(p<0.001);试验组和对照组比较,细胞增殖下降,细胞凋亡增加(p<0.001)。结论:重组质粒pBudCE4.1-53-16构建成功,经体外转染白细胞细胞后2个目的基因能够在细胞中同时表达,并引起细胞周期阻滞于G0期,细胞凋亡增加。

牛α-IFN及FMDV P12A3C双表达载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

从口蹄疫病毒Asia I/Jiangsu毒株的细胞毒中提取总RNA,通过RT-PCR方法分别获得FMDV的P12A及3C基因;同时以pMD18-T-α-IFN质粒为模板,PCR扩增得到α-IFN基因。将α-IFN基因及FMDV P12A及3C基因连接至双启动子表达载体pBudCE4.1上,构建成双效表达质粒pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C,经电泳、PCR、双酶切和DNA测序鉴定表明双效质粒载体构建成功。用此重组质粒转染BHK-21细胞后并对其表达情况进行检测,表明该双表达质粒在BHK-21细胞中能够成功表达。以此重组质粒免疫乳鼠后12 h,按100 TCID50/0.1 mL的量进行攻毒,结果发现该质粒能够抑制病毒的增殖,对乳鼠有一定的保护作用。结果表明成功构建了牛α-IFN及FMDV P12A3C组合基因双表达载体,为进一步研究口蹄疫基因疫苗提供前期基础。

bFGF和NT3基因共表达质粒对豚鼠庆大霉素耳蜗损害的防治作用研究

目的探讨pBudCE4.1-bFGF-NT3基因共表达载体对豚鼠庆大霉素耳蜗损害的防治疗作用。方法取健康豚鼠造模,分组,即:治疗组、预防组、对照组、NT3组、bFGF组。治疗组经右耳圆窗导入pBudCE4.1-bFGF-NT3、bFGF组、NT3组分别导入pCI-bFGF及pUC18-NT3;预防组在肌注庆大霉素前,先行导入共表达质粒;对照组导入SA-EGFP。各组动物分别进行ABR阈值的测试;耳蜗外毛细胞、螺旋神经节细胞计数并观察组织形态学变化。结果ABR阈值测试,预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组与对照组比较差异有显著意义(P<0.01),治疗组与NT-3组、bFGF组比较差异有显著意义(P<0.01),对照组,外毛细胞大面积缺失及细胞水肿坏死,而预防组、治疗组、NT3XEG、bFGF组外毛细胞缺失等渍理性改变均显著减轻。毛细胞计数:预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组与对照组比较差异有显著意义(P<0.01),治疗组与NT-3组、bFGF组比较差异有显著意义(P<0.01)。对照组螺旋神经节细胞大面积坏死肿胀和消失,而预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组仅有少数的螺旋神经节细胞发生退行性病变和损失。螺旋神经节细胞计数:预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组与对照组比较差异有显著性(P<0.01),预防组、治疗组与NT-3组、bFGF组与比较差异有显著性(P<0.01)。NT-3组与bFGF组比较差异有显著性(P<0.01)。结论pBudCE4.1-bFGF-NT3真核共表达载体,可有效预防和治疗庆大霉素对豚鼠耳蜗的损害。

PBudCE4.1/Reg基因联合胰岛素自身抗原防治1型糖尿病的作用研究

目的探讨PBudCE4.1/Reg基因联合胰岛素自身抗原共同防治1型糖尿病的作用及机制。方法构建PBudCE4.1/Reg基因;采用40 mg/kg链脲佐菌素(STZ)连续5 d腹腔注射建立1型糖尿病小鼠模型,小鼠每周肌肉注射Reg基因,皮下注射胰岛素不完全弗氏佐剂(IFA)混合乳剂各1次,连续4周。每周测定小鼠血糖,6周后处死小鼠。采用四唑盐比色法(MTT)检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应;采用流式细胞术(FACS)分析脾淋巴细胞CD4^+CD25^+Foxp3^+调节性T细胞阳性率;采用ELISA法检测小鼠血清胰岛素分泌水平;采用HE染色法进行胰腺组织病理组织学检查。结果 Reg/胰岛素联合给药可有效减少胰岛细胞损伤及炎性细胞浸润,提高糖尿病小鼠胰岛素分泌水平,从而显著降低糖尿病小鼠血糖值(P<0.01),且停药2周后,降糖作用仍持续存存;同时可降低脾淋巴细胞增殖能力(P<0.01),促进CD4^+CD25^+ Foxp3^+调节性T细胞分化(P<0.05)。结论 Reg基因联合胰岛素自身抗原对STZ诱导的T1DM模型有明显的抗糖尿病作用及协同效应,作用机制可能与免疫耐受的诱导及β细胞修复再生有关。

RegⅢ/胰岛素原双基因质粒的构建及其对1型糖尿病小鼠的治疗作用

构建含小鼠RegⅢ和胰岛素原基因的双基因质粒,观察其对1型糖尿病小鼠的治疗作用,并初步探讨其作用机制。采用连续小剂量STZ腹腔注射的方法建立1型糖尿病小鼠模型,肌内注射给予RegⅢ/胰岛素原双基因质粒,治疗4周,每周给药1次,动态监测小鼠血糖的变化;并通过Western blotting、ELISA、MTT、HE病理组织学分析及Tunel检测等方法研究其作用机制。结果表明,双基因质粒可显著改善1型糖尿病小鼠的高血糖症状(P<0.01),抑制脾淋巴细胞增殖,恢复1型糖尿病小鼠体内Th1/Th2反应的平衡和胰岛素的正常分泌;HE及Tunel分析表明,双基因质粒可减少胰岛炎性细胞浸润和胰岛细胞的凋亡。提示RegⅢ/胰岛素原双基因质粒对1型糖尿病具有明显的治疗作用,其作用机制与诱导免疫耐受和促进β细胞再生有关。

鼻咽癌细胞中S100A8与S100A9基因的克隆及其质粒构建和表达

我们发现S100A8和S100A9蛋白质不仅在鼻咽癌患者血浆中水平高于健康人,而且在鼻咽癌组织及培养细胞中也存在高表达。本研究的目的是在鼻咽癌细胞中克隆S100A8和S100A9基因并构建表达质粒和在鼻咽癌细胞中表达,为内源性S100A8和S100A9蛋白质与鼻咽癌发生发展的关系研究奠定基础。PCR扩增目的基因S100A8和S100A9片段,将其插入载体p Bud CE4.1构建S100A8-S100A9-p Bud CE4.1表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后转染至人鼻咽癌细胞系(CNE1)进行表达并用Real time-PCR及Western Blot进行检测。PCR、双酶切和测序结果显示,S100A8和S100A9氨基酸序列无变异(S100A8有1个碱基突变),表达质粒S100A8-S100A9-p Bud CE4.1构建正确。Real Time-PCR和Western Blot结果显示,S100A8和S100A9基因在CNE1中正确转录与表达。成功克隆S100A8和S100A9基因并构建S100A8-S100A9-p Bud CE4.1表达质粒且可在鼻咽癌细胞中稳定表达。