pEGFP-N2-BMP2转染诱导P19细胞分化为心肌样细胞

目的探讨真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞后能否诱导其分化为心肌样细胞。方法实验分转染组和对照组,转染组以真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞并使骨形态发生蛋白2(BMP2)基因稳定表达,然后结合细胞聚集培养,对照组为培养的P19细胞。两组细胞聚集培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4d、8d、12d、16d,免疫细胞化学和Western blotting方法检测心肌标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌动蛋白α;半定量RT-PCR检测心脏早期转录因子GATA-4和NKx2.5基因的表达。结果转染组心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白形成聚集体贴壁4d时无表达,8d、12d、16d出现表达,其表达随时间延长逐渐增强。取材各时间点之间有显著差异(P<0.01)。在转染诱导后4d时GATA-4、NKx2.5两个基因即出现弱的表达,随着时间延长,8d、12d、16d两个基因的表达逐渐增强。取材各时间点之间有显著差异(P<0.01)。对照组未发现心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白的表达,亦未发现GATA-4、NKx2.5两个基因的表达。结论稳定表达BMP2基因的P19细胞可以分化为心肌样细胞,BMP2可能通过调控转录因子GATA-4、NKx2.5进而影响心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α的表达。

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体(EGFP)的融合表达质粒pEGFP-N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和Kpn I酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA,以逆转录后cDNA为模板,PCR扩增获得SET基因片段,经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP-N2载体中,获得重组质粒pEGFP-N2-SET。以LipofectamineTM 2000为载体,将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果经DNA测序鉴定证实,pEGFP-N2-SET重组质粒构建成功,经荧光倒置显微镜观察,证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。

人朊蛋白基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人朊蛋白基因(PRNP)真核表达重组质粒。方法从阿尔茨海默病(AD)患者外周血白细胞中提取总RNA,利用RT-PCR的方法扩增编码人PRNP的基因片段,应用基因重组技术将人PRNP基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,经XhoⅠ及EcoRⅠ双酶切、单酶切及基因序列测定证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得人PRNP的基因片段,限制性内切酶酶切分析、PCR法及序列测定证实为正确重组质粒,并且该重组载体能够在SH-SY5Y细胞中表达。结论构建的真核表达重组质粒pEGFP-N2-PRNP通过鉴定,结构正确,为后续研究PRNP的生物学功能奠定了基础。

MafA真核表达载体的构建及在人肝癌细胞中的表达

目的:构建肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)真核表达载体pEGFP-N2/MafA,pEGFP-C1/MafA,观察MafA在人肝癌细胞HepG-2细胞内的表达。为研究Mafa基因功能和作用机制奠定基础。方法:提取胰腺总RNA,经RT-PCR获得MafA基因片段,在两端分别引入Hind Ⅲ和Sal Ⅰ的酶切位点,重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2,pEGFP-C1中,用脂质体方法转染至人肝癌细胞HepG-2细胞中,通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测MafA基因和insulin Ⅱ基因的表达。结果:通过RT-PCR获取了MafA基因并成功克隆入载体,转染的细胞有绿色荧光蛋白表达及MafA基因表达,但没检测到insulin Ⅱ基因表达。结论:成功构建质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,并成功表达MafA基因,但没有insulin Ⅱ基因的表达。

LIM矿化蛋白-1与LIM矿化蛋白-3共转染骨髓间充质干细胞的基因表达

目的探讨LIM矿化蛋白(LIM mineralization protein,LMP)-1和LMP-3双基因共转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)的表达情况。方法采用人工设计合成人LMP-1和LMP-3基因片段,分别与质粒pEGFP-N2连接,经酶切、测序鉴定后。分离培养新西兰兔BMSC,用脂质体包裹转染BMSC,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染LMP-1基因组(C组)、转染LMP-3基因组(D组)、LMP-1与LMP-3双基因共转染组(E组)。采用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法检测LMP-1和LMP-3的表达。结果酶切及测序表明真核表达质粒pEGFP-N2-LMP-1和pEGFP-N2-LMP-3构建成功。E组可同时较高水平表达LMP-1和LMP-3分子。对RT-PCR及蛋白质印迹法检测结果行灰度值测量并行统计学分析显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,5组间差异有统计学意义(P<0.05),但E组与C组的差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,5组间差异有统计学意义(P<0.05),且E组与D组差异也有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共转染的BMSC能在体外同时表达LMP-1与LMP-3,为基因修复骨缺损带来新思路。