子宫平滑肌细胞SM22-α基因的pEGFP-C3载体构建及siRNA筛选

为研究SM22-α基因在子宫平滑肌中作用机制提供实验基础,通过筛查siRNA有效序列,来构建含SM22-α基因的pEGFP-C3-SM22-α载体.首先构建含有SM22-α基因的pEGFP-C3载体;其次利用FT293细胞并采用Western-bolt检测SM22-α蛋白表达的改变,筛查到siRNA有效序列;得到含SM22-α基因pEGFP-C3-SM22-α载体和干扰SM22-α表达蛋白的siRNA有效片段,成功干扰SM22-α蛋白在子宫平滑肌中的表达.

pEGFP-C_3-insig2融合基因真核表达质粒的构建、表达及其对下游基因的影响

目的构建insig2基因的真核表达质粒,转染3T3-L1细胞并观察对下游脂肪酸结合蛋白(AP2)mRNA、脂联素mRNA表达的影响。方法采用RT-PCR法获取小鼠全长insig2基因,并克隆入真核表达载体pEGFP-C3中。酶切、测序鉴定后,经脂质体转染入3T3-L1细胞,通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达及下游基因的变化。结果成功地构建了pEGFP-C3-insig2融合基因的真核表达载体,荧光显微镜观察到pEGFP-C3-insig2融合蛋白在转染的3T3-L1细胞胞质中的表达,insig2基因的转录明显上调。转染后24h、72h较0hAP2 mRNA和脂联素mRNA的转录水平明显下调。结论构建了insig2基因的真核表达质粒,在转染的3T3-L1细胞中insig2的过表达可能影响该细胞的脂肪代谢。

小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C_3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。

Chitosan-DNA介导关节基因转移的体外研究

目的 :探索体外Chitosan对关节软骨细胞、滑膜细胞的转染。方法 :分离培养兔正常滑膜细胞、软骨细胞 ,使用荧光质粒 pEGFP -C3作为报道基因 ,制备Chitosan -DNA超微颗粒转染兔正常软骨细胞、滑膜细胞 ,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果 :Chitosan能将DNA带入胞内 ,该DNA超微颗粒随时间的延长可缓慢进入胞内 ,其包被的DNA也可以被缓慢释放 ,且对软骨细胞的转染能力强。结论 :Chitosan在体外可介导关节软骨细胞、滑膜细胞基因转移 ,为今后关节疾病非病毒基因转移的研究提供实验依据。

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synu-clein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR I、BamHI两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定。以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株。结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功。RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达。结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株。

碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体转染骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病

背景:研究证实骨髓间充质干细胞可以明显提高糖尿病大鼠胰岛功能恢复及改善高血糖状态,可能与自体胰腺干细胞分化能力增强有关。目的:验证碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(PEGFP-C3-BFGF)转染骨髓间充质干细胞并移植入糖尿病大鼠体内后,对大鼠糖尿病的治疗效果。方法:通过重组腺病毒(Ad.a FGF)介导PEGFP-C3-BFGF转染入骨髓间充质干细胞,利用荧光显微镜观察PEGFP-C3-BFGF的表达。将80只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、移植组及基因转染组,每组20只,采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,模型建立后于对照组给予门静脉注射生理盐水,糖尿病组门静脉注射PBS液,移植组门静脉注射骨髓间充质干细胞悬液1 mL,基因转染组门静脉注射等量转染PEGFP-C3-BFGF的骨髓间充质干细胞悬液。利用RT-PCR法检测各组大鼠胰岛组织中基质金属蛋白酶的m RNA表达差异;检测移植后24 h,3 d,7 d,14 d,21 d各组大鼠血糖水平;移植后3周利用ELISA法检测各组大鼠血浆胰岛素分泌水平;苏木精-伊红染色观察大鼠胰腺组织病理变化。结果与结论:(1)荧光显微镜观察到PEGFP-C3-BFGF转染入骨髓间充质干细胞48 h后,呈现出明显的特异性绿色荧光;(2)移植后2周与对照组比较,糖尿病组的基质金属蛋白酶m RNA表达明显增加(P<0.05),移植组及基因转染组基质金属蛋白酶m RNA的表达较糖尿病组明显下降(P<0.05);(3)移植后不同时间点各组大鼠血糖比较,基因转染组<移植组<糖尿病组,但基因转染组仍>对照组(均P<0.05);(4)移植后不同时间点各组大鼠血浆胰岛素分泌水平比较,基因转染组>移植组>糖尿病组,但基因转染组仍<对照组(均P<0.05);(5)各组大鼠胰腺组织病理情况比较,移植组优于糖尿病组,基因转染组又优于移植组,接近于对照组。(6)结果说明,PEGFP-C3-BFGF转染骨髓间充质干细胞移植入糖尿病大鼠体内,可以改善大鼠血糖水平,促进胰岛素的分泌,其可能是通过下调基质金属蛋白酶mR NA的表达从而改善大鼠糖尿病病变程度。

大鼠睫状神经节神经营养因子真核表达载体转染成肌细胞并促其分化

目的应用DNA重组技术构建大鼠睫状神经节神经营养因子(CNTF)真核表达载体,再稳定转染肌源性干细胞,分析转染的肌源性干细胞能否稳定表达CNTF、并向神经元样细胞分化,为深入研究CNTF的功能及动物体内试验打下理论基础。方法用RT-PCR扩增大鼠带有Xho I和BamH I双酶切位点的CNTF cDNA片段,经双酶切获得的目的片段,再与双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组质粒转化E.coli DH5α感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。采用脂质体转染法,参照Lipofectamine2000试剂盒(LF2000I,nvitrogen公司)说明书,采用阳离子脂质体介导两组质粒(pEGFP-C3-CNTF和pEGFP-C3)转染成肌细胞。通过RT-PCR分析CNTF mRNA在成肌细胞中的表达,用神经元特异性蛋白(NES)免疫组化染色法鉴定是否有神经元样细胞分化,并于显微镜下计数阳性细胞占细胞总数的比例。结果通过PCR扩增成功获得了CNTF cDNA目的片段,大鼠CNTF真核表达载体构建成功,并成功转染成肌细胞,被转染的成肌细胞稳定表达CNTF并显著分化为神经元样细胞、实验组显著高于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。结论大鼠CNTF真核表达载体pEGFP-C3-CNTF可以成功构建,并可转染大鼠成肌细胞,经转染的成肌细胞能有效表达大鼠的CNTF,且转染的成肌细胞显著分化为神经元样细胞,为研究大鼠CNTF在神经损伤修复方面的实验奠定了重要基础。

多聚乙烯亚胺介导基因转染的体外研究

目的考察并确定多聚乙烯亚胺(PEI)最佳的体外细胞转染条件,评价PEI作为基因转染试剂的可行性。方法以MTT法检测不同相对分子质量PEI的细胞毒性。以PEI为载体,在不同的N/P比值条件下,将绿色荧光蛋白基因导入人Ⅱ型肺上皮A549细胞,以荧光显微镜及荧光分光光计系统检测其转染效率。结果相对分子质量为25×103的PEI,当N/P比值为10时,其转染效率最高。结论PEI是一种价格低廉、低毒性、高效率的基因转染载体,可应用于体内外基因治疗。

hTERT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。

小鼠Bicc1基因RNAi序列的筛选与鉴定

通过网上提供的生物信息学分析软件进行搜索和比对,初步筛选到3个较好的针对小鼠双尾-C(Bicc1)基因的RNA干扰(RNAi)序列。合成这3个干涉序列片段后克隆到pRS-HushshRNA载体中。构建Bicc1基因的真核表达载体pEGFP-C3-Bicc1,将绿色荧光蛋白(GFP)标签标记在Bicc1蛋白上。利用细胞转染技术将pEGFP-C3-Bicc1与3个干涉序列载体共转染至体外培养的HEK-293细胞中,最后通过细胞荧光强度、半定量PCR和Westernblotting鉴定出其中两个序列(pRS-Hush-RNAi-Bicc1-N/-C)能明显降低Bicc1蛋白在HEK-293细胞中的表达水平,为下一步建立起低表达Bicc1的稳定细胞株和研究小鼠Bicc1的功能提供了良好的材料。

稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立及鉴定

目的构建人c-jun氨基末端激酶3（c-jun N—terminal kinase 3，JNK3）真核表达载体，并在人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）中稳定表达以探讨JNK3对细胞凋亡的影响。方法以pDBleu—JNK3为模板，PCR扩增人JNK3基因全长，目的片段亚克隆至真核表达载体pEGFP—C3，酶切及测序鉴定。Lipofeetamine^TM 2000转染SHSY5Y细胞，并通过G418选择性培养建立稳定表达JNK3的SHSY5Y细胞系，荧光垃微镜下观察细胞中JNK3表达，RT—PCR、Western印迹检测JNK3表达。结果成功构建了pEGFP—C3-JNK3真核表达载体，并建立了稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系，与对照组相比，其人JNK3基因表达明显升高。结论稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立，为进一步研究人JNK3的功能及其与细胞凋亡的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。

嵌合锚定融合分子在T淋巴细胞的荧光表达及检测

目的构建含有由抗肿瘤相关糖蛋白72(anti-TAG72)单链抗体片段(single chain variable fragment,scFv)及CD28胞内区及跨膜区的融合基因anti-TAG72 scFv-CD28的重组绿色荧光表达载体pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28,并转染获得嵌合锚定T淋巴细胞。方法将anti-TAG72单链抗体及CD28胞内区及跨膜区基因的嵌合锚定融合分子克隆入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C3,获得pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28表达载体。用卡那霉素筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定。将上述重组质粒pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28以脂质体法瞬时转染外周血单核细胞(PBMC),以获得嵌合锚定T淋巴细胞,用荧光显微镜检测嵌合分子anti-TAG72 scFv-CD28在PBMC中的表达,并检验嵌合锚定融合分子anti-TAG72 scFv-CD28的表达。结果重组绿色荧光表达载体pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28中anti-TAG72 scFv-CD28片段为1 002 bp,与已知的序列相符。酶切、测序结果表明,嵌合锚定融合分子基因片段anti-TAG72 scFv-CD28被正确插入pEGFP-C3载体;转染后anti-TAG72 scFv-CD28片段及绿色荧光物质表达于嵌合锚定T淋巴细胞胞膜表面及胞浆中,为绿色荧光显色。结论完成了绿色荧光表达载体pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28的构建,并成功在PBMC瞬时表达。

pEGFP基因启动子区甲基化的梯度降落PCR定量检测法

目的改进亚硫酸氢钠测序法,并在CMV基因启动子甲基化检测中进行验证。方法提取pEGFP-C3质粒重组人肝癌细胞株HepG2 DNA,亚硫酸氢钠化学修饰,针对修饰后质粒基因CMV启动子序列设计特异引物并结合梯度降落PCR扩增,T-A载体克隆、测序,目标区域甲基化定量。结果 pEGFP-C3质粒基因约600bp的CMV启动子区甲基化水平可以精确定量,检测结果与标准品一致,重复测量结果稳定。结论改进后亚硫酸氢钠测序法能明显减少非特异性扩增,提高PCR效率,更适于基因甲基化状态的检测。