小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C_3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。

五种重组人源IL-18突变子表达质粒的构建及其在BxPC-3细胞中的表达

目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础。方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平。结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达。

pEGFP-C_3-insig2融合基因真核表达质粒的构建、表达及其对下游基因的影响

目的构建insig2基因的真核表达质粒,转染3T3-L1细胞并观察对下游脂肪酸结合蛋白(AP2)mRNA、脂联素mRNA表达的影响。方法采用RT-PCR法获取小鼠全长insig2基因,并克隆入真核表达载体pEGFP-C3中。酶切、测序鉴定后,经脂质体转染入3T3-L1细胞,通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达及下游基因的变化。结果成功地构建了pEGFP-C3-insig2融合基因的真核表达载体,荧光显微镜观察到pEGFP-C3-insig2融合蛋白在转染的3T3-L1细胞胞质中的表达,insig2基因的转录明显上调。转染后24h、72h较0hAP2 mRNA和脂联素mRNA的转录水平明显下调。结论构建了insig2基因的真核表达质粒,在转染的3T3-L1细胞中insig2的过表达可能影响该细胞的脂肪代谢。

小鼠Bicc1基因RNAi序列的筛选与鉴定

通过网上提供的生物信息学分析软件进行搜索和比对,初步筛选到3个较好的针对小鼠双尾-C(Bicc1)基因的RNA干扰(RNAi)序列。合成这3个干涉序列片段后克隆到pRS-HushshRNA载体中。构建Bicc1基因的真核表达载体pEGFP-C3-Bicc1,将绿色荧光蛋白(GFP)标签标记在Bicc1蛋白上。利用细胞转染技术将pEGFP-C3-Bicc1与3个干涉序列载体共转染至体外培养的HEK-293细胞中,最后通过细胞荧光强度、半定量PCR和Westernblotting鉴定出其中两个序列(pRS-Hush-RNAi-Bicc1-N/-C)能明显降低Bicc1蛋白在HEK-293细胞中的表达水平,为下一步建立起低表达Bicc1的稳定细胞株和研究小鼠Bicc1的功能提供了良好的材料。

2016—30表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法

本法属于基因工程技术领域，具体公开了一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。本方法将犬流感HA基因依次插入pMDl8-T、pEGFP-C1、pVAX-E3质粒后，成功将HA基因进行修饰后，再将修饰后的HA基因片段重组到pPoly2-CAV2-ZkE3载体中，成功构建及病毒包装后在MDCK细胞中获得稳定遗传的pPoly2-CAV2-HA疫苗载体，扩大了犬流感疫苗的研发市场，为后期犬流感疫苗的研制及相关的基础研究提供支持。

口腔组织病理学

20071502人共刺激分子B7-H3表达载体的构建及表达检测／邹多宏…∥中国口腔颌面外科杂志．-2006，4（5）．356～360从淋巴细胞中提取RNA，用RT-PCR方法将B7-H3的编码序列eDNA扩增。然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP-C1中，构建成最终的表达载体pEGFP-C1-B7-H3。