建立pEGFP—N1-TGF-β1重组质粒和脂质体介导转染原代培养新生猪AEC-Ⅱ方法

目的构建pEGFP—N1—TGF-β1重组质粒，利用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）中，为构建实验性干预急性肺损伤的真核表达载体及转染原代培养AEC-Ⅱ提供方法学基础。方法应用含人TGF—β1CDS的质粒，设计PCR引物扩增出其CDS片段，将其与空质粒pEGFP—N1用Xhol和EcoRI双酶切，T4DNA Ligase连接双酶切产物，将连接产物转化入DH5α中，培养16h后抽提质粒，PCR法鉴定和测序证实TGF—β1 CDS序列正确。采用Lipofectamine 2000脂质体介导转染，将新生猪AEC—Ⅱ原代培养48h至细胞融合80％-90％，换为无血清培养液；将质粒DNA（pEGFP—N1-TGF—β1重组质粒）和Lipofectamine 2000加至DMEM培养液中混匀，置于培养箱中培养4—6h，更换为完全培养液；转染24—48h后，荧光显微镜下观察细胞EGFP表达水平。结果PCR法及测序鉴定证实TGF—β1 CDS序列正确，重组质粒构建成功，采用Nanovue超微量分光光度计测浓度质粒浓度为195．5μg/mL，转染后48h在荧光显微镜下可见细胞有绿色荧光表达，证实已将其成功转染入原代培养的AEC—Ⅱ中。结论成功构建了pEGFP-N1—TGF-β1真核表达载体，并首次采用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪AEC—Ⅱ中，为开展其他实验性干预ALI的基因转染并进一步研究其修复作用及转归提供方法学基础。