pEGFP-N3-LPL重组真核表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础.

牛支持细胞和成纤维细胞体外培养及pEGFP-N3转染

试验以新生牛睾丸组织、牛胎儿皮肤组织为材料,进行支持细胞、成纤维细胞的分离、纯化、鉴定及pEGFP-N3载体转染。结果表明,完善犊牛支持细胞、胎牛皮肤成纤维细胞体外培养体系,细胞纯度可达95%。支持细胞在相同密度下较成纤维细胞能更快完成细胞生长指数期,生长迅速。转染pEGFP-N3载体后,初期EGFP均匀充满胞浆,后期EGFP向细胞核聚集,荧光强度明显高于细胞质中。转染后24、48、72 h,成纤维细胞转染效率高于支持细胞,转染pEGFP-N3的成纤维细胞和支持细胞在转染48 h后达到最大转染效率。转染后成纤维细胞的存活时间明显高于支持细胞,这与支持细胞生物学性质有关。

S100A9真核表达载体pEGFP-N3-S100A9的构建及其对U251细胞生长的影响

目的构建S100A9真核表达载体pEGFP-N3-S100A9,观察其对胶质瘤细胞系U251内S100A9基因表达及细胞生长的影响。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建pEGFP-N3-S100A9融合蛋白表达载体,并用双酶切、测序进行鉴定,用脂质体转染胶质瘤细胞系U251细胞。荧光显微镜下动态观察U251细胞绿色荧光的变化;培养24 h后提取转染细胞的总RNA及总蛋白。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)观察其mRNA表达情况,Western blot检测其蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果酶切鉴定与S100A9全长基因长度一致(345 bp);测序证实重组质粒中含有一与GenBank上登录的S100A9基因(NM_002965)序列完全一致的片段,表明成功构建真核表达载体;荧光显微镜下转染U251细胞可见绿色荧光蛋白表达,12 h后逐渐增多,24～48 h达高峰,且稳定表达较长时间;24 h后通过qRT-PCR检测到mRNA表达,Western blot检测到14×103目的蛋白表达(P<0.05),其增殖能力明显增强(P<0.01),且引起细胞G1期减少,S期增加(P<0.05)。结论成功构建真核表达载体pEGFP-N3-S100A9,转染到U251细胞后能有效上调S100A9基因的mRNA及蛋白的表达、促进细胞增殖。

犊牛睾丸支持细胞稳定转染pEGFP-N3的研究

为获得稳定表达绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)的支持细胞,试验分离纯化了犊牛睾丸支持细胞,然后利用Lipofectamine 2000进行转染和G418筛选。结果表明:利用胶原酶和胰酶消化,结合差速贴壁培养法,能获得较纯的支持细胞,细胞表达波形蛋白,纯度达到95%以上。G418筛选两周后,可得到稳定整合pEGFP-N3的支持细胞克隆。

pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定

目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列。将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法转染Top10感受态细胞(转染组),同时设空白对照组(仅转染pEGFP-N3质粒)和未转染组(不予转染)。采用Western blot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。结果总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求。构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708 bp处和4 700 bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致。DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确。Western blot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.657 3±0.032 5,空白对照组为0.301 7±0.028 7,未转染组为0.314 3±0.026 6,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础。

关岭牛pEGFP-N_3-UCP3重组真核表达载体的构建

旨在构建不含CMV启动子的p EGFP-N3-UCP3重组真核表达载体。利用PCR技术克隆UCP3基因启动子,扩增不含CMV区的p EGFP-N3载体片段,将UCP3启动子与该载体经连接、转化后,挑取阳性克隆进行PCR鉴定及测序鉴定。结果表明,成功地构建了重组载体p EGFP-N3-UCP3,为UCP3基因转录调控机制的研究奠定了基础。

犊牛睾丸支持细胞的培养及不同浓度pEGFP-N3载体瞬时转染

为了研究支持细胞的分离、纯化、鉴定、传代培养及pEGFP-N3载体转染,试验以新生牛睾丸组织为材料,以脂质体介导转染支持细胞。结果表明:支持细胞的纯度达95%,可传至20代;细胞密度为2.5×105个/孔时,3.0μL的脂质体、2.4μg的pEGFP-N3质粒为最佳组合,转染72 h后效率可达36.03%。

鸡鸭异种间转基因嵌合体的制备

为研究异种间嵌合体的制作方法及供体和受体的嵌合情况,同时探讨绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值。本研究利用脂质体介导法将外源pEGFP-N3质粒转入到北京鸭原始生殖细胞(PGCs)中,将转染后的PGCs以微注射法转移至受体北京油鸡的胚下腔,探索转基因鸡鸭嵌合体的制作方法。结果显示:PGCs在转染后6 h开始有外源基因的表达,体外培养24 h后获得了33.6%的转染效率。120枚蛋在整个孵化期中共有33枚鸡胚发育,但最终无孵化成活鸡。在13个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为10.8%。PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,8只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞。研究结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因禽类是可行的。鸭PGCs能够迁移并定居到鸡胚性腺中,并有可能在鸡性腺中增殖分化成有功能的配子。

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mR-NA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。

猪瘟病毒NS4B真核表达载体的构建与表达

猪瘟病毒NS4B蛋白是猪瘟病毒编码的一个非结构蛋白,由347个氨基酸残基组成。NS4B在病毒中可能与致细胞病变有关,具体功能尚不清楚。本试验利用PCR扩增NS4B基因,利用双酶切、连接和转化等操作方法,与质粒载体p EGFP-N3构建成真核表达重组质粒,双酶切检测猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。测定重组质粒序列,并验证表达成功,为今后的功能研究奠定了基础。

PiggyBac转座子介导关岭牛UCP3基因启动子重组质粒的构建与鉴定

为了构建以PiggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,含UCP3基因启动子的PiggyBac转座子二元系统PB-513B-UCP3,并验证其转座活性,试验采用PCR技术扩增获得UCP3基因启动子,分别通过T4DNA连接酶与质粒PB-513B-1和pEGFP-N3连接,构建重组质粒PB-513B-1-UCP3和pEGFP-N3-UCP3-pro;用脂质体法将质粒pEGFP-N3、重组质粒pEGFP-N3-UCP3-pro和PB-513B-1-UCP3以及PiggyBac转座子二元系统分别转染至小鼠成肌细胞C2C12中,检测其在小鼠成肌细胞C2C12中的表达情况。结果表明:PCR扩增得到大小为1080bp的单一目的条带;经酶切和测序鉴定,成功构建重组质粒PB-513B-1-UCP3和pEGFP-N3-UCP3-pro,PiggyBac转座子二元系统的阳性克隆数明显多于重组质粒PB-513B-1-UCP3和pEGFP-N3-UCP3-pro的克隆数。说明试验成功构建了PiggyBac转座子介导的重组质粒PB-513B-1-UCP3及pEGFP-N3-UCP3-pro,且证实PiggyBac转座子介导的牛UCP3基因启动子在小鼠成肌细胞C2C12中具有较高的转座活性。