人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的 本研究旨在构建人可溶性白介素_1受体 (sIL_1R)真核表达载体pcDNA3 sIL_1R ,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法 将人sIL_1R基因的RT_PCR纯化产物及质粒pcDNA3 1(+)DNA经KpnI和XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后 ,体外连接酶切片段 ,使其定向重组 ,再将重组DNA转化E .coliCompetentCellsJM10 9,经复苏后 ,在含Ampr 的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果 挑取的LB固体培养基上的 6个单菌落经酶切及测序鉴定 ,证实均为阳性克隆 ,即sIL_1R与pcDNA3 1(+)体外重组成功。结论 采用体外重组技术 ,成功地将人sIL_1RcDNA插入了真核表达载体pcDNA3 1(+)

抑制GATA-3基因表达的RNAi载体构建和筛选

GATA-3在Th2免疫网络中起至关重要的作用。本研究的目的是构建和筛选出能够高效、特异性抑制GATA-3基因表达的siRNA质粒载体。在小鼠P815细胞中转染以GATA-3作为靶基因的PSi338、PSi717和PSi1232的干涉质粒载体,通过RT-PCR和Western blot方法分别从转录和蛋白质水平观察它们对GATA-3基因表达的影响。结果表明:PSi338、PSi717均能明显抑制P815细胞中GATA-3 mRNA的表达和GATA-3蛋白的合成。结论:成功地构建和筛选出两条高效、特异性抑制GATA-3基因表达的siRNA质粒载体。

猪瘟病毒NS4B真核表达载体的构建与表达

猪瘟病毒NS4B蛋白是猪瘟病毒编码的一个非结构蛋白,由347个氨基酸残基组成。NS4B在病毒中可能与致细胞病变有关,具体功能尚不清楚。本试验利用PCR扩增NS4B基因,利用双酶切、连接和转化等操作方法,与质粒载体p EGFP-N3构建成真核表达重组质粒,双酶切检测猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。测定重组质粒序列,并验证表达成功,为今后的功能研究奠定了基础。

Pim-3质粒构建体在大鼠活体肝组织的表达和活性的研究

目的构建大鼠 Pim-3绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒并观察其在活体肝组织的表达和活性。方法采用逆转录 PCR 的方法获取目的 cDNA,重组质粒经酶切鉴定和测序;大鼠活体基因肝靶向性转染通过尾静脉流体力学注射法完成,肝细胞凋亡的诱导采用腹腔内注射内毒素和 D-半乳糖胺(D-GalN)来实现。动物分为 A、B、C 和 D 组(即正常、对照、空质粒和重组质粒组,每组8只);肝组织 GFP 表达通过荧光显微镜、Pim-3表达通过逆转录(RT)-PCR 方法检测;肝细胞凋亡采用缺口末端标记技术(TUNEL)分析和半胱天冬酶-3活性检测。结果成功构建 GFP 表达质粒 pEGFP-N2/Pim-3;重组质粒和空质粒 DNA 通过流体力学注射法被成功转染入大鼠活体肝组织内;4组 Pim-3的相对表达水平分别为0.06±0.02、0、0、0.49±0.15。D 组与其他3组差异均有统计学意义(均 P<0.01);4组肝细胞的凋亡指数(AI)分别为:(3.1±0.7)%,(72.5±6.1)%、(69.8±5.7)%和(4.9±1.2)%;肝组织半胱天冬酶-3活性分别为(60±15)、(147±55)、(142±50)和(76±27)pmol·min^(-1)·mg^(-1),D 组与 B、C 两组间差异有统计学意义(均 P<0.01)。结论构建的重组体质粒 pEGFP-N2/Pim-3能在大鼠活体肝组织内有效表达,并发挥其对肝细胞凋亡的抑制效应。

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的构建周期型马来丝虫（Bm）半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）重组复合基因真核表达质粒，观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应。方法将重组质粒pGEM—T／BmCPI和pGEM—T／BmGAPDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切，构建真核重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH。将纯化的pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸（CpGODN）免疫BALB／c小鼠，并设PBS对照组及空质粒对照组，共免疫3次，每次间隔2周。采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平。统计学分析采用t检验。结果pcDNA3．1（＋）-BmcPI／BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后，从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因。免疫6周后，pcDNA3．1（＋）-BmCPI／CpG组和pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH／CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1．466±0．635和1．610±0．112，显著高于PBS组的1．004±0．019和pcDNA3．1（＋）-CpG组的1．078±0．129（t=64．438、45．318、42．749、34．314，均P〈0．05）。免疫4周后，pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH／CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3．1（＋）-CpG组（t=288．053、76．453，均P〈0．05），其中IFN-γ水平与pcDNA3．1（＋）-BmCPI／CpG组相比也有明显提高（t=129．642，P〈0．05）。结论pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达，并可有效诱导特异性细胞免疫应答。